免疫亲和色谱与分子印迹技术(一)

复杂样品中痕量农药残留的分离、净化和浓缩是农药残留分析中最繁杂的工作，对分析的准确性和可靠性影响很大。传统的分离净化手段如液液分配、薄层色谱、柱色谱净化等费时费力，需要使用较多的有机溶剂，复杂的样品前处理过程还容易造成痕量目标分析农药的变性和损失。同相萃取等方法利用目标分析物与杂质理化性质的差异实现分离净化，其选择性仍然有限，对于一些理化性质相近的非目标分析物还是难以有效分离去除，对后续的分析会产生干扰。因此研究开发具有高选择性分离富集功能的农药残留分离净化技术是农药残留分析技术的重要研究内容之一。

一、免疫亲和色谱

Axen等(1967)和Cuatrecasas(1968)的开拓性工作奠定了免疫亲和色谱(immuno-affinity chromatography，IAC)的研究基础。从20世纪80年代后期开始，免疫亲和色谱作为一项颇具发展潜力的高效分离富集技术受到关注，国内外已有不少关于应用免疫亲和色谱法分离富集不同物质的文献报道，对复杂样品提取液中的目标分析农药、兽药、毒素、各种蛋白质等具有显著的分离纯化效果，富集效率高。蛋白质粗提液经过免疫亲和色谱净化，可达到电泳纯水平，并具有很高的回收率。因此免疫亲和色谱在医学检验、食品卫生检验、环境监测等领域具有很高的研究应用价值。

(一)免疫亲和色谱基本原理及主要特点

免疫亲和色谱是利用抗原与抗体的高亲和性、专一性和可逆结合的原理而建立的一种色谱方法。农药的免疫亲和色谱是以抗农药特异性抗体为配体，将其固定到适当的固相载体上，制备免疫亲和色谱固定相和免疫亲和色谱柱，利用农药小分子的反应原性和抗原抗体结合的特异性以及在一定条件下可逆解离的原理进行色谱分离。当含有目标分析农药的粗提液经过免疫亲和色谱柱时，样液中对该抗体有亲和性的农药就被选择性地结合到同定相上，淋洗去除非目标分析物后，在适当条件下用少量溶剂洗脱，可选择性地分离富集目标分析农药。免疫亲和色谱通常只需“加样-洗涤-洗脱”一步色谱就可使复杂样品中极微量的特定组分得到高度纯化和浓缩，所得分离物比固相萃取物纯度高，浓缩倍数可达数百甚至上千倍，便于直接采用气相色谱、高效液相色谱等方法进行检测，大大提高了样品前处理效率，减少了有机溶剂的使用和提取过程中目标分析物的损失，具有特异性强、柱容量大、洗脱条件温和等特点。免疫亲和色谱柱还可以很方便地再生和重复利用，非常适用于复杂样品中痕量农药残留的分离与富集，可有效降低样品分析的检测限，提高分析灵敏度。

(二)农药免疫亲和色谱法的建立

1、抗农药抗体的制备与纯化

在农药的免疫亲和色谱中，作为固定相配体的抗农药抗体是最为关键的材料。合成保持并突出目标分析农药结构特征的半抗原，将半抗原共价结合到一个大分子载体(如牛血清白蛋白等)上制备人工抗原，以人工抗原免疫动物或采用杂交瘤技术制备对目标分析农药具特异性亲和力的多克隆(polyclona1 antmody，PcAb)或单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)。从20世纪90年代开始，利用基因工程技术制备抗体的研究工作逐渐开展起来，这无疑会为规模化生产高性能抗体和免疫亲和色谱柱开辟了一条新途径。

抗体的纯度是制备高容量、高选择性免疫亲和色谱柱的主要因素之一。采用硫酸铵三步盐析法从抗血清中分离出的抗体，须进一步纯化后才能作为配体，用于制备免疫亲和色谱固定相。抗体的纯化方法包括二乙氨乙基纤维素吸附法、离子交换柱色谱法及亲和色谱法。二乙氨乙基纤维素对血清蛋白的吸附力远高于对免疫球蛋白(IgC)的吸附力，可以有效去除血清中的非免疫球蛋白。蛋白A和蛋白G与IgC有很强的亲和力，以蛋白A或蛋白G为配体的亲和色谱，条件温和，可以有效纯化抗体并保持抗体的免疫学活性。以人工抗原作为配体的亲和色谱，也是获得高活性纯化抗体的有效途径之一。一般情况下，以农药半抗原与载体蛋白的耦联物为人工抗原，以该人工抗原免疫动物制备多克隆抗体，其中有一部分抗体可能是针对载体蛋白的。所以可在抗血清或多克隆抗体溶液中加入适量载体蛋白进行反应，然后离心去除载体蛋白一抗体复合物，再分离去除杂蛋白，可使抗目标分析农药的特异性抗体得到纯化。

2、免疫亲和色谱固相基质的选择

近年来，商品化的免疫亲和色谱固相基质越来越多。理想的免疫亲和色谱固相基质应该具备的条件有：①亲水性好，以便与亲水性的配体(抗体)和水溶液中的目标分析物有较好的相容性；②其载体本身对非目标分析物没有吸附或非特异性吸附非常小；③具有适当数量的化学基团可供活化以便与适当数量的配体有效耦联；④有较好的物理稳定性和化学稳定性，能耐受配体固定化和亲和色谱中可能采用的各种条件(如pH、离子强度、温度、洗脱剂等)的影响；⑤具有多孔的网状结构，能够耦联更多的配体，被亲和吸附的目标分析物能够自由地通过，从而增大配体与目标分析物的结合量；⑥有良好的机械性能，能够承受一定的柱压，在使用条件下不变形，保持稳定的柱体积。为使流动相有较好的流速，免疫亲和色谱固相基质最好是均一的球状颗粒。

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