乳酸乳球菌胞外多糖提取纯化工艺研究（一）

乳酸乳球菌胞外多糖（EPS）为乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一类多糖类化合物。由于乳酸菌相比其他工业用菌安全性高，故近年来对乳酸菌胞外多糖的研究也逐渐增多。从已有的研究结果来看，合成EPS的乳酸菌中乳酸乳球菌合成能力较强，为80～600mg/L。胞外多糖作为食品添加剂，可用作多种食品的增稠剂、稳定剂、乳化剂和凝胶剂；具有生物活性如免疫活性、抗肿瘤和抗溃疡，可应用于医药领域，分子量大约为4.0×10⁴～6.0×10⁶之间。尽管长期以来研究者们对乳酸菌产EPS的化学组成存在着分歧，但是较一致认为：从乳酸菌中分离得到的胞外聚合物是由α-和β-连接糖重复单元所组成的多糖，并且不同乳酸菌分泌的EPS类型不同。虽然单糖组成可能有些相似，多为半乳糖、葡萄糖和鼠李糖，但是各成分比率不同。由于发酵液中EPS的产量较低、蛋白质含量较高，给EPS的提取带来较大困难。因此，发酵液中提取EPS工艺关键即是蛋白质的除去与EPS的沉淀，可得到稳定、易使用、杂质少的多糖产品。本实验对乳酸乳球菌发酵液通过不同的条件进行提取纯化EPS，验证最佳除蛋白条件和多糖沉淀条件，为工业化生产乳酸菌胞外多糖奠定理论基础。

一、材料与方法

1、材料与试剂

乳酸乳球菌乳亚种LL9（以下简称乳球菌LL9）：郑州轻工业学院实验室提供，由乳酸乳球菌乳亚种6242（中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC））紫外诱变，经葡萄糖耐受及乳链菌肽耐受水平筛选挑出，比较生物活性最终筛出活性高、乳链菌肽产量高的最优化菌株。

分离纯化条件为：发酵液→添加三氯乙酸至2.5%（w/v）→500r/min搅拌5min→4℃沉淀除蛋白20min→10000r/s离心20min除菌体→上清液透析12h→苯酚硫酸法测定EPS。可得乳酸菌胞外多糖的产量为262.63mg/L。

6%的苯酚溶液：精确称取6.0g重蒸酚晶体，用少量的蒸馏水溶解后倒入100mL的容量瓶中，定容、充分摇匀，倒入棕色试剂瓶中备用。

2、实验方法

（1）菌种活化

保存于甘油管中乳球菌LL9接种于MRS液体培养基内，37℃培养，传代2～3次后，染色镜检，挑选优良菌株，转接斜面培养，4℃冰箱冷藏保藏备用。

（2）摇瓶发酵

活化后菌液5%转入摇瓶发酵，37℃恒温150r/min震荡培养24h。

（3）发酵液处理

取发酵终点发酵液，10000×g下离心8min去除菌体，取上清液备用。

（4）苯酚硫酸法测定

EPS该方法较适合乳酸菌EPS检测，相对误差为0.2%，具有较好的准确性。透析液经稀释取2.0mL加入1.0mL6.0%的苯酚溶液，5.0mL95.0%的浓硫酸，静置10min，高速振荡器上振荡摇匀，静置20min至冷却。490nm测定OD值。标准曲线上查找对应糖含量，即得乳酸菌胞外多糖产量。

（5）提取纯化工艺流程

斜面→MRS液体培养基活化两次（37℃，24h）→摇床扩大培养（37℃，150r/min，24h）→离心去除菌体（5mL，10000×g，8min）→添加三氯乙酸50%（w/v）（12h）→500r/min搅拌5min→离心沉淀除蛋白（4℃，18000×g，30min）→上清加乙醇沉淀多糖（100%，3倍体积，4℃，处理12h）→离心（12000×g，30min）→冷冻干燥→沉淀温水溶解（稀释10倍）→透析MD34（4℃，处理12h）→苯酚-浓硫酸法测定OD值→EPS纯度鉴定

二、结果与分析

1、苯酚硫酸法标准曲线绘制

用葡萄糖作为标准物，绘制标准曲线。由图1可知，糖浓度在0～32mg/L时，糖浓度和透光度呈线性关系。

2、除蛋白条件优化

（1）除蛋白中三氯乙酸浓度的优化

将发酵液通过离心的方法除去菌体后，分别加入30%、40%、50%的三氯乙酸溶液1/5体积，探讨不同三氯乙酸浓度对蛋白质沉淀的影响，如图2所示。三氯乙酸浓度在30%～50%时与发酵液多糖产量呈正比关系，三氯乙酸浓度过高会对多糖的结构产生影响，因此初步确定除蛋白阶段三氯乙酸的最优浓度为50%。

（2）除蛋白中离心力优化

本实验中发酵液细胞分离后，加入50%的三氯乙酸溶液1/5体积，分别在10000×g、12000×g、13000×g、16000×g离心力下离心30min，选取最优化离心条件，如图3所示。在离心力16000×g时，多糖得率达到最大值，选16000×g为最优离心力。

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