超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鸡肉和鸡蛋中25种兽药残留（二）

2结果与讨论

2.1前处理条件的优化

2.1.1提取试剂的优化

本实验考察了4类兽药在乙腈和甲醇中的提取效果。结果表明，甲醇提取的样品中蛋白质、脂肪等杂质较多，后续净化难度增加且对目标物有较大干扰，大多数药物的回收率较差；而乙腈渗透性强，对多数目标化合物有较高的提取率，且沉淀蛋白质效果较好，可以减少强极性杂质和弱极性杂质的提取，因此选择乙腈为提取试剂。

2.1.2样品水解液的优化

磺胺类、喹诺酮类药物在生物体内易与蛋白结合产生较强的结合力，影响药物的提取效率。若将乙腈直接加入高蛋白样品中会导致蛋白质急剧变性凝聚，使提取液不能充分接触药物，提取效率偏低。但在加入乙腈前先加入一定体积和浓度的酸或碱溶液，可破坏这一结合力和细胞结构，促使结合态药物解离为游离态，充分释放到提取液中，且水解后样品含水量增加还可减缓蛋白质的变性速度，增大提取试剂与药物的接触面积，提高药物的提取效率；另外，酸、碱还可抑制化合物酸、碱基团的解离，提高其转移到乙腈层中的效率。实验考察了向样品中加入相同浓度稀盐酸、氨水、甲酸、磷酸氢二钾溶液水解后药物的提取效果。结果表明，碱溶液水解的鸡蛋样品乳化现象较严重，乙腈与基质及水相难以分离；而酸水解的分层较好，其中加盐酸的样品中大多数药物的回收率更高，对盐酸浓度和体积优化后，确定以5mL2mol/L盐酸水解样品。

2.1.3盐析试剂的优化

由于水解样品时带入大量水而影响提取试剂的浓缩效率。本实验考察了向提取液中加入过量的无水硫酸钠、无水硫酸镁、碳酸钠、碳酸氢钠及氯化钠以除去水。结果表明，除氯化钠外，其余4种均不能使乙腈和水分层，无水硫酸钠及无水硫酸镁在本实验中的使用量不仅不能将水全部去除，还使部分兽药被吸附而降低回收率。而氯化钠的盐析作用可促使水相中的药物大量转移到乙腈层中，同时提取液中大量蛋白质沉淀于水相，避免了提取液浓缩时产生泡沫而溢出的损失。因此，向提取液中加入过量氯化钠至饱和(约7～9g)，待乙腈和水分层后取出乙腈层再进行后续实验。

2.1.4提取次数的优化

本实验考察了鸡蛋、鸡肉样品水解后，每次加入15mL乙腈分别提取1、2、3次后各药物的回收率，结果列于表2。可见，提取1次部分药物及相应内标物的提取效率有较大差异，部分药物超出兽药残留对回收率(70%～120%)的要求；提取2次的回收率最好；提取3次的干扰峰增多。因此，选择每次加入15mL乙腈重复提取2次。

2.1.5净化试剂的优化

提取液浓缩至干后，残留物中有大量油状物，因此先于提取液中加入8～10mL正己烷除脂后测定。结果表明，大多数药物的回收率高于除脂前，且灵敏度增强，但磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、洛美沙星和培氟沙星的回收率较差。若使用8～10mL环己烷-正己烷溶液，则磺胺间甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉的回收率在70%～120%之内，其余药物的回收率也很好。因此，选择8～10mL环己烷-正己烷溶液去除提取液中的脂肪。

此外，部分氯化钠溶于乙腈中，易对仪器造成污染。由于氯化钠在乙酸乙酯中的溶解度较小，因此，将样品提取液浓缩至干后，加入2mL含不同浓度甲酸的乙酸乙酯溶解、过滤，考察对氯化钠去除效果及药物回收率的影响。结果表明，乙酸乙酯溶解后均有大量氯化钠析出，经0.22μm有机滤膜过滤，去除氯化钠后大多数药物的回收率高于去除前，尤其是洛美沙星和培氟沙星，其中以0.2%甲酸-乙酸乙酯溶解的样品最好。通过计算样品提取液去除氯化钠前、后的药物基质效应(ME)(ME=空白基质标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率-1)×100%)发现，去除氯化钠后部分药物基质效应大大减弱，示于图1。由此推测，氯化钠对药物回收率有较大影响，选择0.2%甲酸-乙酸乙酯溶液溶解残留物去除氯化钠。

2.1.6净化方式的优化

样品中含有色素、糖、有机酸、矿物质等多种杂质，会减弱色谱柱的性能，影响仪器使用寿命。PSA可有效吸附糖类、色素、有机酸，C18可吸附脂肪和一些矿物质等，因此，实验将C18与PSA混合作为吸附剂，分别采用分散固相萃取法和改良分散固相萃取法(按1.4.2节操作)对经前两步净化后的提取液再净化。结果表明，由于改良分散固相萃取法中待净化液与填料接触更加充分，去除杂质效果更好，回收率较高，大多集中在80%～110%范围内。最终选择C18为30mg，PSA为60mg为吸附剂的改良分散固相萃取法对样品进行净化。

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