高效液相色谱双波长法测定复方罗布麻片Ⅰ中3组分含量

复方罗布麻片Ⅰ是由罗布麻叶、野菊花、防己3味中药及泛酸钙、氢氯噻嗪、维生素B6、维生素B1、硫酸双肼屈嗪、盐酸异丙嗪组方的复方制剂，是临床常用降血压药，药效协同，成分复杂。现行质量标准中仅有氢氯噻嗪的含量测定和盐酸异丙嗪的薄层鉴别，过于简单，不利于产品质量的控制。本研究中参考文献，分析了极性及稳定性等性质来确定溶剂、固定相及流动相，最终采用高效液相色谱双波长法同时测定该复方制剂中泛酸钙、氢氯噻嗪及维生素B6的含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AD型高效液相色谱仪，配有LC-20AD型紫外可见光度检测器(日本岛津公司);Elmasonic P 60H型超声仪(德国Elmasonic公司，功率为320 W，频率为80 k Hz);XS-105型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，精度为十万分之一);BINDER PD60型电热干燥箱(德国Binder公司)。

1.2 试药

泛酸钙对照品(批号为100370-201402，纯度为97.5%)，氢氯噻嗪对照品(批号为100309-201103，纯度为99.8%)，维生素B6对照品(批号为100116-201103，纯度为99.9%)，均购自中国食品药品检定研究院;复方罗布麻片Ⅰ(某药业集团有限公司，批号分别为151001,151002,151003);庚烷磺酸钠、乙腈、甲醇均为色谱纯，水和冰醋酸均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:0.12%庚烷磺酸钠(A，冰醋酸调p H至3.0)-乙腈(B)，梯度洗脱(程序见表1);流速:1.0 mL/min;柱温:35℃;检测波长:泛酸钙200 nm，其他275 nm;进样量:20μL。

2.2 溶液制备

对照品贮备液:取泛酸钙对照品12.5 mg，氢氯噻嗪对照品16.0 mg，维生素B6对照品12.5 mg，精密称定，分别置50 mL,10 mL,25 mL容量瓶中，泛酸钙和维生素B6加流动相溶解稀释，氢氯噻嗪先加2 mL甲醇超声溶解，再加流动相稀释至刻度，即得对照品贮备液A,B,C。

对照品溶液:精密量取上述对照品贮备液A,B,C各1 mL，分别置10,100,10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得对照品溶液A,B,C。

供试品溶液:取本品20片，研细，取粉末适量(约相当于氢氯噻嗪3.2 mg)精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇适量，加流动相适量，超声处理30 min，使其溶解，加流动相稀释至刻度，过滤，即得。

阴性对照品溶液:按处方比例制备不含泛酸钙、氢氯噻嗪及维生素B6的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

阴性干扰试验:取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各适量，分别按2.1项下色谱条件进样测定。结果对照品溶液与供试品溶液色谱在相同保留时间处有对应色谱峰出现，阴性对照无干扰。色谱图见图1。

线性关系考察及检测限与定量限测定:分别精密吸取对照品贮备液A,B,C各1,3,5,10,15,20 mL，分别置50 mL容量瓶中，流动相定容，按2.1项下色谱条件进样测定。以峰面积(Y)为纵坐标、对照品质量浓度(X，μg/mL)为横坐标进行线性回归。分别以信噪比(S/N)为3∶1和10∶1为基准测得各化合物的检测限和定量限。结果见表2。

精密度试验:分别精密量取上述对照品溶液A,B,C各20μL，注入液相色谱仪，连续测定6次，记录峰面积。结果泛酸钙、氢氯噻嗪、维生素B6峰面积的RSD分别为0.34%,0.12%,0.08%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取2.2项下供试品溶液，分别于0,3,6,9,12,24 h时按2.1项下色谱条件进样测定。结果泛酸钙、氢氯噻嗪、维生素B6峰面积的RSD分别为1.18%,0.35%,0.31%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验:取同一批(批号为151001)样品6份，依法制备供试品溶液，以外标法计算泛酸钙、氢氯噻嗪及维生素B6的含量。结果含量的RSD分别为0.31%,0.29%,0.53%(n=6)，表明方法重复性良好。

加样回收试验:取已知含量的同一批(批号为151001)样品1片，研细取粉末，置50 mL容量瓶中，依法制备供试品溶液，分别加入对照品溶液适量，进样20μL，测定含量，并计算回收率。结果见表3。

2.4 样品含量测定

取样品(批号分别为151001,151002,151003)，依法制备供试品溶液，分别精密量取20μL，进样测定峰面积，按外标法计算含量。结果3批样品中泛酸钙、氢氯噻嗪、维生素B6的平均含量分别为43.26%,95.54%,52.38%。

3 讨论

3.1 色谱柱选择

曾比较Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),Phenomenex Gemini C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),Agilent 5HC C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),Waters Symmetry Shield C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)的色谱图，以分离度为优化指标，结果4种色谱柱的分离度分别为3.125,1.875,3.075,1.950，故色谱柱选择Kromasil C18柱。

3.2 溶剂选择

参考文献，氢氯噻嗪在水中不溶，在乙醇中微溶。流动相中有机相比例小，故先采用适量甲醇超声溶解，加流动相定容。泛酸钙极不稳定，易降解，水溶液中显中性或弱碱性，流动相为酸性环境，故泛酸钙极易降解，需要及时配制。样品中含有多种中药，成分复杂，且流动相中离子对浓度大，故应对色谱柱进行保护。

3.3 波长选择

因泛酸钙无最大吸收波长，故于200 nm波长处末端吸收测定含量，另2种物质氢氯噻嗪和维生素B6的最大吸收波长分别为271 nm和291 nm。考虑到含量测定的均衡性，确定测定波长为275 nm。因此，泛酸钙测定波长选择200 nm，氢氯噻嗪和维生素B6测定波长选择275 nm。

3.4 方法评价

本研究中建立的高效液相色谱双波长法，同时测定复方罗布麻片Ⅰ中3组分的含量，简便易行，可操作性强，重复性好，结果准确，可用于复方罗布麻片Ⅰ中泛酸钙、氢氯噻嗪和维生素B6的含量测定。

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