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将酶解好的样品用MALDITOF/TOF质谱仪(美国AppliedBiosystems)对样品进行测定,选择合适的仪器参数获得肽质量指纹图谱(PMF)。
所有数据至少为3次平行试验的平均值。采用Origin9.0绘图,SPSS19.0进行显著性检验,P<0.01为极显著,P<0.01为极显著,多重比较采用Duncan检验。
如图1所示,随着降解过程的进行,0h时处理组蛋白点均较少,4℃-1h和25℃-0.5h时,蛋白点增多,同时低分子蛋白区出现蛋白点,表明肌原纤维蛋白被降解成小分子多肽或蛋白质。随后,在4℃-2h和25℃-1h时,蛋白点变得模糊,并发生拖尾等聚焦不彻底的情况。这可能是由于降解过程中蛋白质二、三级结构发生变化,出现蛋白质聚集和氨基酸改性所致。
利用PDQuest软件对4℃处理0,1,2h及25℃处理0,0.5,1h样品的2-DE图谱进行重复性和匹配率的检测,对2-DE图谱蛋白点表达差异进行比较分析。差异蛋白点检测标准为:若某一个蛋白点在不同组之间的相对丰度的比值大于2,且t-testP<0.05,即认为该点为差异蛋白点。经过分析得到,4℃组和25℃组分别存在45个、30个差异蛋白质点,如图4所示。差异蛋白点的局部放大图如图2及图3所示。
在对如图4所示的总计75个差异蛋白质点割胶取点的过程中,删除掉4和25℃重复的点,以及割胶失败的点,共获得独立可进行质谱鉴定的蛋白质点24个。其中4℃组中共有14个蛋白点,分别是点3504,0510,6406,3413,1005,1105,1410,0014,1012,0007,6512,5506,0116,6407;25℃组中共有10个蛋白点,分别是2402,2304,5302,5104,2204,4108,0214,5503,5504,2203。对割胶成功的24个蛋白质点进行胶内酶切后质谱鉴定,得到24个蛋白点的肽指纹图谱。
表5列出的Level9级别的差异蛋白质的细胞组成分类,结果显示,蛋白质主要以骨架结构部分(cytoskeletalpart)为主。收缩纤维部分(contractilefiberpart)及肌原纤维(myofibril)各自包含1个蛋白点,为点3504;中间丝骨架(intermediatefilamentcytoskeleton)包含2个蛋白质,分别为点5504及6407;肌动蛋白骨架(actincytoskeleton)包含4个蛋白点,分别为3504,5503,5506,6512;骨架结构部分(cytoskeletalpart)包含6个蛋白点,分别为3504,5504,6407,5503,5506及6512。表明在降解过程中,主要是肌原纤维蛋白的骨架结构发生破坏。Ayala等发现鲷鱼在0℃贮藏期间肌原纤维蛋白降解速度非常快,其中主要是细胞骨架蛋白被降解。
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