运用超高效液相色谱-生物化学检测在线联用分析方法筛选中药中的丁酰胆碱酯酶抑制剂（二）

2.3 UPLC-DAD-BChE在线分析方法

2.3.1 UPLC色谱条件

色谱柱Xtimate UPLC C18色谱柱（2.1 mm ×100 mm，1.8 μm）；柱温：30 ℃；进样量：2 μL；流速：0.08 mL·min-1；流动相:甲醇(B)-0. 1%甲酸水溶液(A)。

吴茱萸色谱条件：检测波长330 nm；梯度洗脱:0～5 min，10%B；5～50 min，10%～45%B；50～70 min，45%～95%B；70～85 min，95%B。

钩藤色谱条件：检测波长 245 nm；梯度洗脱:0～10 min，10%～30%B；30～70 min，30%～45%B；70～90 min，45%～95%B；90～100 min，95%B。

苦参和山豆根色谱条件：检测波长225 nm；梯度洗脱:0～5 min，5%B；10～40 min，5%～50%B；40～80 min，50%～95%B；80～90 min，95%B。

莲心碱色谱条件：检测波长：290 nm；流动相：甲醇（B）-0.1%甲酸溶液（A）（20:80）。

UPLC流速：0.08 mL·min-1；柱后BChE、DTNB混合溶液和BTCI流速分别为0.30 mL·min-1和0.10 mL·min-1。

2.3.2 UPLC-DAD-BCD在线联用仪器系统

UPLC-DAD-BCD联用仪器装置见图1。溶液流路采用三通管和相同内径的PEEK管连接。柱后衍生仪泵一为酶和DTNB混合溶液，泵二BTCI溶液。提取物经过UPLC色谱柱分离后，在PDA检测器显示指纹图谱，再与柱后衍生仪中的溶液反应，经 DAD检测器检测得到活性图谱，酶+DTNB、BTCI溶液流速分别为0.30和0.10 mL·min-1，反应管0.5 mL，在405 nm检测酶抑制活性图谱。其反应原理如下：当柱后衍生仪以恒定的流速运输BChE与DTNB混合溶液和BTCI溶液，3种溶液在反应管中连续反应，生成的5-thio-2-nitrobenzoate为黄色产物，可在405 nm处检测得到平稳基线。当UPLC分离出活性物质进入BChE反应体系，黄色产物量降低，同时在DAD检测器上面就会呈现倒峰，从而实现BChE抑制剂的在线检测。

2.4 UHPLC-LTQ/Orbitrap MS方法

UHPLC分析条件同“2.4.1”，流速为0.2 mL·min-1。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）正离子模式；鞘气（N2）和辅助气（Ar）流速分别为40和10 arb. unit；毛细管温度320 ℃；离子源电压3.5 kV，电流100 μA；一级质谱质量扫描范围为100～1 000 m/z，分辨率为60 000；二级质谱采用HCD模式，依赖一级质谱扫描中的1th到5th强峰，分辨率15 000；HCD裂解能量35 V。

3 结果与讨论

3.1 UPLC-DAD-BChE在线分析方法的考察

流动相中的甲醇和乙腈能降低酶的活性，采用HPLC建立在线检测方法需通过柱后分流降低流动相在酶反应体系的比例，减少对酶活性的影响，此在线联用方式会产生仪器的兼容性等问题，导致在线检测方法稳定性较差。本研究采用UPLC使流速为0.08 mL·min-1，不分流即可满足在线检测的要求。

莲子心被报道具有BChE抑制作用，按照“2.3.2”项下的方法，运用UPLC-DAD-BCD对莲心碱抑制活性进行分析，见图2。图2为五个不同浓度莲心碱的UPLC图谱和BChE抑制峰(60，120，600，1 200和 1800 μg·mL-1)，以活性指纹图谱的倒峰面积为横坐标（X），莲心碱浓度为纵坐标（Y），得到莲心碱的量效曲线方程Y= 351.56X3-1 098.8X2+ 1 473X-32.205 (R² = 0.999 7)，表明UPLC-DAD-BCD方法能够用于酶抑制剂的筛选和活性评价。由图二上和下对应峰的保留时间可得在线检测的延迟时间为2 min左右。

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