运用超高效液相色谱-生物化学检测在线联用分析方法筛选中药中的丁酰胆碱酯酶抑制剂（三）

3.2 中药中BChE抑制剂的快速筛选

运用UPLC-DAD-BCD方法对吴茱萸、钩藤、苦参和山豆根提取物中的BChE抑制剂进行筛选结果见图3。吴茱萸中有4个峰在405 nm检测中显示倒峰，表明具有BChE抑制活性。钩藤中有3个倒峰、苦参中有5个倒峰、山豆根中有2个倒峰。其中吴茱萸中的4号峰显示较强的BChE抑制活性。在线分析方法由于是流动性的反应检测，更能快速发现活性较强、酶抑制速度快的成分。

3.3 活性成分鉴定

为了明确吴茱萸、钩藤、苦参和山豆根提取物中的活性成分，采用UHPLC-LTQ/Orbitrap MS方法分别对4种中药中出现倒峰的成分进行鉴定。根据各峰保留时间、质谱信息等与参考文献相比较，结果显示峰1，2，3，4，6，7，8，9分别为去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、1-甲基-2--4(1H)-喹诺酮、去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱、苦参碱和氧化苦参碱，其中峰5，10，11和12有待进一步研究加以鉴别。活性成分鉴定结果见表1。

化合物1：来源于吴茱萸，保留时间42.56 min，正离子模式，其准分子离子为m/z302.1281+，二级质谱显示其主要碎片m/z 287.105 4 +和286.0984+，结合文献初步推测化合物1为去氢吴茱萸碱。

化合物2：来源于吴茱萸，保留时间72.87 min，正离子模式，其准分子离子为m/z304.144 3+，二级质谱显示其碎片m/z286.096 9+，m/z171.091 8为准分子离子断裂Ｂ环+，m/z161.071 1准分子离子断裂C环+，m/z144.080 8和134.060 0分别为+和+，结合文献初步推测化合物2为吴茱萸碱。

化合物3：来源于吴茱萸，保留时间75.13 min，正离子模式，其准分子离子为m/z288.112 9+，二级质谱显示其主要碎片m/z273.102 2+，m/z244.086 9为准分子离子脱去C2H4O，m/z145.039 6为C环断裂脱去C10H8N·，结合文献初步推测化合物3为吴茱萸次碱。

化合物4：来源于吴茱萸，保留时间81.60 min，正离子模式，其准分子离子为m/z366.2783+，二级质谱显示其主要碎片m/z352.891 6 +，322.490 2为+，186.091 9为+，结合文献初步推测化合物4为1-甲基-2--4(1H)-喹诺酮。

化合物6：来源于钩藤，保留时间68.88 min，正离子模式，其准分子离子为m/z367.201 4+，二级质谱显示其主要碎片m/z335.175 9，298.143 6，224.128 0和144.080 7，分别为准分子离子丢失CH3OH、C4H7N、C10H9N和C12H17NO3的碎片，结合文献初步推测化合物6为去氢毛钩藤碱。

化合物7：来源于钩藤，保留时间72.93 min，正离子模式，其准分子离子为m/z369.2165+，二级质谱显示其主要碎片m/z337.190 6，298.143 9，226.143 6和144.080 7，分别为准分子离子丢失CH3OH、C4H9N、C10H9N和C12H19NO3的碎片，结合文献初步推测化合物7为毛钩藤碱。

化合物8：来源于苦参和山豆根，保留时间8.04 min，正离子模式，其准分子离子为m/z249.195 7+，二级质谱显示其主要碎片m/z231.185 5+，结合文献初步推测化合物8为苦参碱。

化合物9：来源于苦参和山豆根，保留时间14.12 min，正离子模式，其准分子离子为m/z265.190 5+，二级质谱显示其主要碎片m/z247.190 8+，m/z205.138 3+，m/z 148.112 5+结合文献初步推测化合物9为氧化苦参碱。

3.4 讨论

本研究建立了一种UPLC-DAD-BCD在线分析方法，用于快速筛选吴茱萸、钩藤、苦参和山豆根4种药材中的BChE抑制剂，发现12个成分具有BChE抑制活性，通过UHPLC-LTQ/Orbitrap方法鉴定出8种活性成分，如：去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、1-甲基-2--4(1H)-喹诺酮、去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱、苦参碱和氧化苦参碱。研究表明，建立的仪器联用系统稳定、在线分析方法灵敏，能够广泛用于中药复杂基质中生物效应成分的快速筛查。

中药成分复杂多样，传统植物化学分离纯化活性成分的方法，存在资源消耗，大量的人力物力投入到分离已知的和没有意义的化合物研究，本研究方法采用高效色谱分离、流动注射在线反应、生物化学实时检测于一体的在线分析技术，快速评价单一成分生物效应，只需少量的样品即可满足活性成分的筛选和鉴定，为中药复杂基质中新的生物活性物质的快速发现，提供了一种高效、便捷的分析策略。

本研究建立的在线UPLC-DAD-BCD方法能够用于快速筛查其他酶或受体生物效应成分，通过对中药复杂成分的不同靶点活性分析，为阐释中药及复方药效物质的多靶点协同作用机制及配伍规律组方原理提供一种有效的研究方法和技术手段。

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