同位素稀释气相色谱-串联质谱法测定动物源食品中克霉唑残留量（二）

1.2.7色谱条件

HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，程序升温：初温60℃，保持1min，以30℃/min升至200℃，冉以15℃/mjn升至300℃，保持5min。进样口温度240℃，不分流进样，进样量1μL，载气为氦气(纯度≥99.999％)，流速1.0mL/min。

1.2.8质潜条件

电子电离源(EI)，电离能量70eV，离子源温度280℃，传输线温度300℃，多反应监测(MRM)模式，具体条件见表1。
 

1.3数据处理

采用Tracefinder3.0软件处理数据。

2结果与分析

2.1质谱参数的优化

在EI电离源下，采用SCAN模式，对5.0mg/L的克霉哗及克霉唑-d₅分别进行一级质谱全扫描分析，选择丰度最高的作为母离子。在不同碰撞能量下，对目标物的母离子分别进行二级质谱扫描，得到每个母离子的碎片离子，选择丰度较高的3个子离子，配制不同种类的空白样品基质标准溶液，在MRM模式下优化各种质谱条件，剔除易受杂质干扰，选择半度最高的2个子离子作为定量离子和定性离子，最后再对每对离子对的碰撞能做优化以达到最佳灵敏度。标准溶液MRM色谱图见图1。

2.2前处理条件的优化

2.2.1提取

实验中发现使用常规的高速均质提取猪肥肉(猪脂肪)和猪肉(同时含猪肥肉和精肉)时，由于样品粘在均质刀头上，无法充分和提取溶剂接触，导致克霉哗的提取效率不高。本实验首先将样品在碾钵中与硅藻土充分混匀研磨，硅藻土颗粒不仅能吸收样品中的水分，且能和样品的肌肉或脂肪组织充分接触，使后续ASE提取时有机溶剂能充分渗透到样品中，大大提高了克霉唑的提取效率。考虑到与后续GPC净化流动相的匹配，本实验选择了乙酸乙酯/环己烷(体积比1:1)为提取溶剂。

2.2.2净化

动物源食品或多或少含有一定量的脂肪，去除脂肪是前处理必须解决的问题。凝胶渗透色谱是去除脂肪的有力工具，但是实验中发现通过GPC无法完全去除脂肪，否则会造成部分克霉唑损失回收率偏低，故在GPC之后还需要通过分配步骤使残余脂肪和克霉哗分离。GPC洗脱液氮气吹干后在离心管底有脂肪析出，还需将收集到的洗脱液于45℃的水浴中氮气吹至近干，取0.5mL乙腈饱和的正己烷涡旋振荡溶解残余物，再加入0.5mL正己烷饱和的乙腈，涡旋振荡并静置分层，吸出乙腈层于2mL进样小瓶中，向刻度离心管中重复加入0.5mL正己烷饱和的乙腈重复操作一次，合并乙腈层，过0.22μm滤膜于GC-MS/MS的进样小瓶中，制得待测样品溶液，供GC-MS/MS测定的步骤通过液液分配使脂肪和克霉唑分离，使用0.5mL正己烷(乙腈饱和)溶解残渣，再用0.5mL乙腈(正己烷饱和)反提取克霉哗，试验中共用0.5mL乙腈(正己烷饱和)重复提取3次，考察每次乙腈层中克霉唑的分布，结果发现用2次提取即能达到90％的回收率，故采用0.5mL乙腈(正己烷饱和)提取2次，合并乙腈层供GCS-MS/MS测定。

2.3方法学验证

2.3.1线性关系与定量限

采用内标法对克霉唑标准品10mg，用乙腈溶解并转移至100mL容量瓶中，用乙腈定容，制得100μg/mL克霉唑标准储备液；取克霉哗-d₅标准品1mg，用乙腈溶解并转移至10mL容量瓶中，用乙腈定容，制得100μg/mL克霉哗-d₅标准储备液。用乙腈稀释配制浓度分别为1、2、5、20、50、100μg/L的系列标准工作溶液，其巾克霉哗-d₅同位素内标溶液浓度均为20μg/L。制备的1、2、5、20、50、100μg/L系列基质标准工作溶液进行上机测定，以克霉哗与克霉哗-d₅的峰面积比值为纵坐标(Y)，克霉哗的质量浓度为横坐标(X，μg/L)绘制标准曲线。结果表明，在1、2、5、20、50、100μg/L浓度范围内，克霉唑线性关系良好，回归方程为Y=0.0189426+0.0474255X，决定系数(R²)为0.9995。定量限(LOQ)采用在空白样品中逐级降低加标浓度的方法来确定，得到克霉唑的定量限(LOQ，S/N≥10)为2.0μg/kg。

2.3.2回收率与精密度

在不同动物源食品的空白样品中，分别进行2.0、5.0、20.0μg/kg三个不同浓度水平的加标回收实验，每个水平重复测定6次，通过同位素内标法计算其回收率和标准偏差(RSD)，结果见表2。采用了同位素内标定量技术，校正了目标物的损失、提高了测量结果的稳定性和重复性，测得克霉唑的回收率在82.6％～116.5％之问，相对标准偏差为5.2％～13.5％，说明该方法的准确度和精密度良好。代表性的样品加标色谱图见图2，在克霉唑出峰处没有杂质干扰，说明本研究采用的净化步骤取得了良好的效果。

2.4实际样品检测

在农贸市场和超市购买不同的动物源食品，猪肉、鸡肉、猪脂肪、猪心、猪肝、猪肾，每种样品各3份，采用本方法进行检测，结果显示，所有的样品中均未检出克霉唑药物残留。

3结论

本文建立了动物源食品巾克霉哗残留量的同位素稀释气相色谱-串联质谱测定方法。样品经加速溶剂提取后，用凝胶渗透色谱净化结合正己烷去除样品中的脂肪，同位素内标定景，校正了目标物的损失、提高了测量结果的稳定性和重复性，保证了方法有较好的回收率和精密度。该方法灵敏度高、准确性好，定量限为2.0μg/kg，同收率在82.6％～116.5％之间，相对标准偏差为5.2％～13.5％，能够满足动物源食品中克霉唑残留量的确证和定量分析，为保障食品安全提供技术支持。

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