液相色谱-串联质谱法同时检测糕点中31种食品添加剂（二）

2结果与分析

2.1样品前处理条件的优化

2.1.1提取溶剂的选择和提取次数的优化

本次实验样品为糕点，因添加剂的极性不同，采用液液提取方式便能将不同极性的添加剂提取出来。实验对比了30%、40%、50%、60%、70%、80%乙腈水溶液，30%、40%、50%、60%、70%、80%甲醇水溶液对添加剂的提取效果，在同一批次的糕点样品中加入质量浓度为100ng/mL的混合标准工作液，提取结果如图1所示，大多数化合物在乙腈水溶液作为提取液时提取效率较高，随着乙腈浓度的增高，提取效率也增高，当乙腈浓度达到50%时，提取效率达到稳定；而在70%甲醇水溶液的时候，提取效率是最高的，由图1可知，在50%乙腈水溶液或70%甲醇水溶液时提取效率几乎相同，但考虑到本实验的样品是糕点，有机溶剂浓度越大，则蛋白沉淀越完全，提取的上清液则越澄清，无絮状物漂浮在上清液中，故选择70%甲醇水溶液作为化合物的提取液。为了确保目标化合物的提取回收率，本实验对70%甲醇水的提取次数进行比较，在糕点中加入100ng/mL的混合标准工作液后超声提取1、2、3次，将每次提取完后上清液都定容上机测定。结果表明，两次提取的回收率在80.6%～113.5%之间，满足实验室的检测要求。为尽量减少前处理的繁琐，及目标化合物的损失，因此，本实验的提取次数选择两次。

2.1.2提取时间的优化

准确称量7份糕点样品1.00g（精确到0.01g），置于50mL离心管中，分别加入质量浓度为100ng/mL的混标溶液，加入10mL70%甲醇，涡旋后在超声下分别提取5、10、20、30min，超声提取，随着超声提取时间的增长，提取效率增加，当超声提取时间到10min时，31种添加剂的色谱峰面积响应值基本达到稳定，为尽量减少前处理的时间，因此，本实验的超声提取时间选择10min。

2.1.3固相萃取柱的考察

糕点样品基质化学成分复杂，一般含有的物质有糖、脂肪、蛋白质等，其脂肪的存在影响目标物的提取与净化，在测定时易产生离子抑制效应，本研究考察了以下6种样品净化方法：（1）HLB固相萃取柱净化，甲醇洗脱；（2）PRIMEHLB固相萃取柱净化，乙腈∶甲醇=90∶10洗脱；（3）MCX固相萃取柱净化，5%氨水甲醇洗脱；（4）WAX固相萃取柱净化，5%氨水甲醇洗脱；（5）MAX固相萃取柱净化，2%甲酸的甲醇洗脱；（6）WCX固相萃取柱净化，2%甲酸的甲醇洗脱。

在考察不同固相萃取柱时，配制400ng/mL的混合标准溶液（5%甲醇作为溶剂），取5mL分别注入已经预处理好的固相萃取柱，并按照以上6种净化方法进行洗脱，各种固相萃取柱对31种目标化合物的回收率见表3。

HLB固相萃取柱的填料由水浸润性的共聚物构成，其结构中同时具有亲水单体和亲脂单体，对于极性化合物和非极性化合物都有很好的保留，无需经过活化和平衡就能有效地吸附各种化合物，是一种优良的可用于酸、碱和中性化合物的亲水-亲脂平衡反相吸附剂；PRIMEHLB固相萃取柱则能更好的去除样品中的磷脂，延长液相色谱柱的使用寿命并避免质谱仪发生离子抑制和污染；MCX、MAX固相萃取柱的填料分别属于用于分析碱类化合物的混合模式阳离子交换吸附剂和分析酸类化合物的混合模式阴离子交换吸附剂；WCX、WAX固相萃取柱的填料则分别属于分析强碱和季胺类化合物的混合模式弱阳离子交换吸附剂、分析强酸化合物的混合模式弱阴离子交换吸附剂。其中MCX、MAX、WCX、WAX四种固相萃取柱适用的化合物范围都各有侧重，HLB固相萃取柱适合的化合物的pH最广，50%以上的目标化合物回收率满足实验要求，由于31种目标化合物中大部分是酸性化合物，其pH小于6，经过WAX固相萃取柱净化后，90%以上的化合物都能达到70%的回收率，基本满足实验要求，最后选择WAX固相萃取柱进行净化。

2.2色谱条件的优化

2.2.1色谱柱的考察

本实验对31种添加剂的进行分离，对色谱柱的分离效果要求较高。本实验考察了3种规格的C₁₈色谱柱，包括KinetexC₁₈色谱柱（2.6μm，2.1×100mm），UltimateXB-C₁₈色谱柱（3μm，2.1×100mm）和AtlantisT₃色谱柱（3μm，2.1×150mm）。KinetexC₁₈色谱柱对结构相似的胭脂红、喹啉黄和柠檬黄3种着色剂保留较差，而UltimateXB-C₁₈色谱柱则对着色剂实现较好的分离，但并不能实现对防腐剂和甜味剂的分离。色谱柱AtlantisT3能使31种添加剂在11min内实现色谱保留和基线分离。

2.2.2质谱条件的优化

本实验进样方式为流动注射泵直接进样，分别对31种添加剂的标准溶液（2μg/mL）进行进样分析。在全扫描模式（Q₁MS）下，选择响应高，同时接近目标物分子电离方式的母离子，并比较母离子在正、负离子模式下的响应情况，最终选取m/z响应值最高的作为定量离子。实验结果显示，山梨酸、苯甲酸等26种添加剂在负离子电离模式下响应值较高，而罗丹明B、碱性橙2等5种添加剂在正离子电离模式下响应值较高。在对应的电离方式下，优化母离子的去簇电压（DP），同时在子离子模式[productIon（MS₂）]下选择两个响应值较高的子离子，在多反应监测（MRM）模式下，对不同化合物的碰撞能量进行优化。

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