响应面法优化绿豆抗氧化肽的制备工艺（三）

（4）绿豆多肽抗氧化性与酶解时间的关系

通过单因素实验的结果，可以筛选出各因素的三个水平。所以在此基础之上，应用统计分析软件建立4因素3水平的Box—Behnken模型，进行回应面优化设计实验条件进行实验，改变酶解时间结果见4所示。

由图4可知，当反应时间不超过2h，DPPH清除率与温度成正比，当反应时间超过2h，DPPH清除率与温度成反比，在2h时DPPH清除率达到峰值。当水解的时间过短时，绿豆蛋白大分子没有水解成具有小分子生物活性的生物活性肽，因而水解物DPPH的清除率较小。而水解的时间过长则会导致大分子蛋白质过度水解成氨基酸或者是已不具备生物活性短肽链的物质。

2、应面实验结果

（1）回归方程模型方差分析

单因素实验讨论了各个因素对绿豆多肽抗氧化性的影响，为了全面考察影响因素，仍需确定酶解时间、酶解温度、pH、酶浓度对绿豆抗氧化肽的抗氧化性的影响。故采用继续用响应法对绿豆抗氧化肽提取的工艺进行优化。以酶解温度(X₁)、酶解pH(X₂)、酶浓度(X₃)、酶解时间(X₄)为自变量，DPPH清除率的响应面实验结果见表2。温度(X₁)、酶解pH(X₂)与酶浓度(X₃)、酶解时间(X₄)为自变量，DPPH清除率为回应值的响应面实验结果见表2。

根据响应面实验设计及其实验结果，需要建立回归方程模型，用于判断各因素之间的交互作用是否显著，为用于研究和分析绿豆多肽抗氧化性的变化，故而还需判断其误差的大小。即实验拟合度与在最佳条件下抗氧化性的吻合程度。绿豆多肽抗氧化性的回归方程模型的方差分析如表3所示。

由表3可知，该回归模型P＜O.000l，方程模型达到极显著，失拟项P=0.1471＞0.05，不显著，说明模型建立正确。该回归模型的总决定系R²=0.9568，说明方程拟合度较好，实验误差小，故该回归方程模型成立，可以用此模型对绿豆多肽的抗氧化性进行分析及预测。由此模型得到的此回归方程为：Y=45.24—6.00X₁+1.47X₂—1.35X₃+0.36X₄+1.81X₁X₂—2.60X₁X₃+1.06X₁X₄+0.20X₂X₃一0.17X₂X₄+0.14X₃X₄—4.98X₁²—0.97X₂²—0.70X₃²—0.90X₄²。

（2）响应曲面结果分析

响应面图可反映出各个因素对绿豆多肽抗氧化性的影响，根据曲面图的开口朝向及曲面形状判断在实验范围内是否存在最值、各因素之间的相互作用是否显著。

结合表3、图5及图6可看出，影响DPPH自由基清除率的先后顺序为：温度(X₁)＞pH(X₂)＞酶浓度(X₃)>酶解时间(X₄)，X₁、X₂、X₃、X_1³项达到互极显著水平(P＜0.01)，X_1²、项达到显著水平(P＜0.05)。响应面的最优条件：温度43.47℃，pH为9.19，酶浓度为6.51％，水解时间为2.22h，DPPH自由基清除率47.14％。

3、验证实验

为了验证响应面结果的可靠性，根据响应面优化出的最佳工艺进行三次验证实验。实际得到的绿豆多肽DPPH清除率的平均值是47.03％，与分析值相差0.23％。与响应面预测值较为吻合，说明响应面得出的最优条件具有可行性。

三、结论

通过响应面优化实验分析出影响绿豆抗氧化肽的制备因素，这四个因素对绿豆抗氧化肽提取的影响程度顺序为：酶解温度＞pH＞酶浓度＞酶解时间。本实验得出的绿豆抗氧化工艺条件为：酶解温度43.47℃、pH9.19、酶浓度6.51％、酶解时间2.22h，在此工艺条件下得到的绿豆抗氧化肽对DPPH清除率的平均值为47.03％，与软件给出的理论值相差0.23％。本实验对绿豆抗氧化肽提取条件进行了优化，且绿豆多肽的抗氧化性为绿豆多肽在抗氧化食品、保健品等方面的开发及药理学研究提供了更为有效的依据。

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