荜茇根化学成分及其抗肿瘤活性

目的研究荜茇PiperlongumL.根的化学成分及其抗肿瘤活性。方法荜茇干燥根茎95%乙醇提取物采用硅胶、SephadexLH-20、重结晶进行分离纯化，根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。MTT法测定其中2种典型生物碱的抗肿瘤活性。结果从中分离得到10个化合物，分别鉴定为β-谷甾醇(1)、胡萝卜苷(2)、二十四烷酸(3)、十九烷酸(4)、荜茇酰胺(5)、胡椒碱(6)、胡椒内酰胺A(7)、胡椒内酰胺D(8)、N-异丁基-(2E,4E,12Z)-十八烷基-1-酰胺(9)、3,4-亚甲二氧基肉桂酸(10)。化合物5对3株肿瘤细胞的IC50值均小于20μmol/L。结论化合物3～4、7～10为首次从该植物中分离得到，化合物5对3株肿瘤细胞表现出显著的细胞毒活性。

荜茇PiperlongumL.为胡椒科胡椒属药用植物,主要产于菲律宾、印尼，在我国云南有野生，具有温中散寒、下气止痛的功效，临床用于治疗胃腹冷痛、食欲不振、消化不良、肾寒、呕吐等症，蒙医、中医都用其果实入药，其温热之性可治疗中焦胃寒等症。维医不同于蒙、藏、中医，不是用荜茇果实，而是用其根茎，作为消化系统的常用药材。

国内对荜茇的研究主要集中在果实化学成分、胡椒碱提取工艺及含量测定等方面，而对荜茇根化学成分的报道较少。因此，本研究对荜茇根进行化学成分分离及鉴定，从中得到10个化合物，其中3～4、7～10为首次从该植物中分离得到，5表现出较突出的抗肿瘤活性。

1材料

B260旋转薄膜蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；XT5显微熔点测试仪(温度计未校正，北京市科仪电光仪器厂)；核磁共振光谱用AvanceⅢ-400MHz核磁共振仪测定(TMS内标,瑞士Bruker公司)；ESI-MS谱用ImpactHDQ-TOF型质谱仪测定(瑞士Bruker公司)；柱层析硅胶(200～300目)、薄层层析硅胶G(青岛海洋化工有限公司)；SephadexLH-20(上海浩然生物技术有限公司)。石油醚、乙酸乙酯、甲醇等试剂均为分析纯。荜茇根采自云南山区，经西北农林科技大学林学院康永祥教授鉴定为胡椒科胡椒属植物荜茇PiperlongumL.的根,阴干后粉碎备用。

2提取与分离

荜茇根在室温下阴干称定质量，约4.5kg，粉碎，加入95%乙醇，静置24h回流提取，重复3次，提取液过滤合并，减压浓缩得到浸提物约470g。荜茇根的浸提物用硅胶拌样，通过硅胶柱色谱用石油醚、乙酸乙酯、甲醇为洗脱剂进行洗脱，最终得石油醚部位24g、乙酸乙酯部位203g、甲醇部位232g。乙酸乙酯部位经硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯及乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，得到9个组分Fr.A1～A9，反复硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱分离，经薄层色谱检识、多次重结晶后，从Fr.A2得到化合物1(465.8mg)、9(48.8mg)，从Fr.A3得到化合物5(12mg)、6(8.59g)、8(20mg)、10(30mg)，从Fr.A4得到化合物7(70.4mg)，从Fr.A5得到化合物2(3.22g)。石油醚部位经硅胶柱层析，油醚-乙酸乙酯及乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，得到9个组分Fr.B1～B9，从Fr.B2得到化合物3(2.16g)，从Fr.B6得到化合物4(30mg)。

3结构鉴定

化合物1:无色针状结晶(石油醚),mp135～137℃。ESI-MSm/z:413[M-H]-,分子式C29H50O。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.36(1H,m,H-6),3.53(1H,m,H-3),0.69(3H,d,H-18),1.03(3H,s,H-19),0.93(3H,d,J=6.5Hz,H-21),0.86~0.78(9H,m,H-26,H-27,H-29)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:36.5(C-1),31.6(C-2),71.8(C-3),42.2(C-4),140.7(C-5),121.7(C-6),31.8(C-7),31.4(C-8),49.6(C-9),36.1(C-10),21.0(C-11),39.7(C-12),40.5(C-13),56.0(C-14),23.8(C-15),28.2(C-16),56.0(C-17),11.8(C-18),18.7(C-19),35.6(C-20),18.7(C-21),33.9(C-22),25.9(C-23),45.7(C-24),28.2(C-25),19.3(C-26),18.7(C-27),22.5(C-28),11.3(C-29)。以上数据与文献一致,故鉴定为β-谷甾醇。

化合物2:白色粉末,ESI-MSm/z:575[M-H]-,分子式C35H60O6,mp296～298℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:5.34(1H,m,H-6),4.90(1H,H-1′),4.44(2H,t,J=11.48Hz,H-6′),4.22(1H,d,J=7.72Hz,H-4′),3.64(1H,m,H-3),0.99(3H,H-21),0.96(3H,H-19),0.91(3H,d,J=6.32Hz,H-26),0.84(3H,H-29),0.80(3H,H-27),0.66(3H,s,H-18)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:140.3(C-5),121.1(C-6),100.7(C-1′),76.8(C-3),76.8(C-3′),76.7(C-5′),73.4(C-2′),70.0(C-4′),61.0(C-6′),56.1(C-14),55.3(C-17),49.5(C-9),45.0(C-24),41.8(C-13),40.2(C-12),38.2(C-4),36.7(C-20),36.1(C-1),35.4(C-10),33.3(C-22),31.3(C-7),31.3(C-8),29.2(C-2),28.6(C-25),27.7(C-16),25.3(C-23),23.8(C-15),22.5(C-28),20.5(C-11),19.7(C-26),19.0(C-19),18.8(C-21),18.5(C-27),11.7(C-18),11.6(C-29)。以上数据与文献一致,故鉴定为胡萝卜苷。

化合物3:白色粉末(石油醚),ESI-MSm/z:367[M-H]-,mp52～54℃。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.89(3H,t,-CH3),1.27(40H,m),1.64(2H,m,-CH2),2.36(2H,t)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:179.7(C-1),33.5(C-2),26.3(C-3),23.1(C-23),13.6(C-24)。以上数据与文献一致,故鉴定为二十四烷酸。

化合物4:白色粉末(石油醚),ESI-MSm/z:297[M-H]-。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.88(3H,t,-CH3),1.27(30H,m,H-4～13),1.64(2H,m,-CH2),2.37(2H,t)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:180.4(C-1),34.5(C-2),27.7(C-3),22.2(C-18),13.1(C-19)。以上数据与文献一致,故鉴定为十九烷酸。

化合物5:白色晶体(甲醇),ESI-MSm/z:316[M-H]-。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:6.04(1H,m,H-3),6.95(1H,m,H-4),2.48(2H,m,H-5′),4.03(2H,m,H-6),6.80(1H,s,H-2′,6′),7.66(1H,d,H-7′),7.69(1H,d,H-8′),3.90(3H,s,OCH3-3′,OCH3-5′),3.85(3H,OCH3-4′)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:166.3(C-2),126.3(C-3),145.9(C-4),25.2(C-5),42.1(C-6),131.1(C-1′),106.0(C-2′,C-6′),153.8(C-3′,C-5′),140.3(C-4′),144.3(C-7′),121.5(C-8′),169.3(C-9′),56.6(OCH3-3′,OCH3-5′),61.4(OCH3-4′)。以上数据与文献]一致,故鉴定为荜茇酰胺。

化合物6:无色方晶(甲醇),mp135～136℃。碘化铋钾反应阳性。ESI-MSm/z:284[M-H]-。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:6.44(1H,d,J=14.6Hz,H-2),7.40(1H,m,H-3),6.77(1H,m,H-4),6.74(1H,m,H-5),6.97(1H,d,J=1.4Hz,H-2′),6.77(1H,d,J=80Hz,H-5′),6.88(1H,dd,J=8.0,1.4Hz,H-6′),5.96(2H,s,-O-CN2-O-),3.55(2H,brs,H-1″),1.61(2H,m,H-2″),1.61(2H,m,H-3″),1.60(2H,m,H-4″),3.46(2H,brs,H-5″)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:165.3(C-1),120.0(C-2),142.4(C-3),125.3(C-4),138.1(C-5),130.9(C-1′),105.6(C-2′),148.1(C-3′),148.0(C-4′),108.4(C-5′),122.5(C-6′),101.3(-0-CH2-O),43.2(C-1″),26.7(C-2″),24.6(C-3″),25.6(C-4″),46.9(C-5″)。以上数据与文献一致,故鉴定为胡椒碱。

化合物7:黄色粉末,ESI-MSm/z:264[M-H]-。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.65(1H,brs,-NH),9.27(1H,m,H-5),7.94(1H,m,H-8),7.77(1H,s,H-2),7.53(2H,m,H-6,7),7.13(1H,s,H-9),4.05(3H,s,4-OCH3)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:57.7(3-OCH3),104.8(C-9),109.0(C-2),114.9(C-4a),116.2(C-1),124.8(C-11),125.4(C-7),127.3(C-6),127.2(C-8a),127.9(C-5),129.2(C-8),134.6(C-5a),135.6(C-10),148.8(C-4),150.1(C-3),169.4(C-12)。以上数据与文献一致,故鉴定为胡椒内酰胺A。

化合物8:黄色粉末,ESI-MSm/z:294[M-H]-。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:3.93(3H,s,C3-OCH3),4.45(3H,s,C4-OCH3),7.26(1H,s,H-9),7.49(2H,m,H-6,H-7),7.88(1H,m,H-8),9.28(1H,m,H-5),9.82(1H,brs,NH)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:61.8(C3-OCH3),62.9(C4-OCH3),105.8(C-9),106.3(C-1),112.2(C-10a),125.6(C-7),126.7(C-6),127.2(C-4a),127.6(C-5a),127.8(C-5),129.2(C-8),134.2(C-9a),135.5(C-10),140.0(C-3),153.7(C-4),154.6(C-2),167.5(-C=O)。以上数据与文献一致,故鉴定为胡椒内酰胺D。

化合物9:油状物。ESI-MSm/z:332[M-H]-,分子式C22H39NO。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.53(1H,br,-NH),5.69(1H,d,J=14.8Hz,H-2),7.18(1H,dd,J=10Hz,H-3),6.11(1H,m,H-4),6.07(1H,m,H-5),2.17(2H,m,H-6),1.25～1.41(14H,m,H-7,8,9,10,15,16,17),2.01(2H,m,H-11),5.35(1H,m,H-12),5.34(1H,m,H-13),2.01(2H,m,H-14),0.89(3H,m,H-18),3.16(2H,t,J=6.4Hz,H-2′),1.68(1H,m,H-3′),0.92(6H,m,H-4,5′)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:166.4(C-1),121.7(C-2),143.2(C-3),128.3(C-4),141.3(C-5),33.0(C-6),28.9(C-7),29.4(C-8),29.6(C-9),29.3(C-10),26.1(C-11),129.5(C-12),129.6(C-13),27.3(C-14),29.4(C-15),32.0(C-16),22.7(C-17),14.1(C-18),46.9(C-2′),28.6(C-3′),20.5(C-4′,5′)。以上数据与文献一致,故鉴定为N-异丁基-(2E,4E,12Z)-十八烷基-1-酰胺。

化合物10:黄色粉末,ESI-MSm/z:191[M-H]-,分子式C10H8O4。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.59(1H,d,J=15.9Hz,3-H),6.96～6.76(3H,d,Ar-H),6.34(1H,d,J=15.9Hz,2-H),5.90(2H,s,-O-CH2-O-)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:179.7(C-1),33.5(C-2),31.4(C-3),29.2(C-4),29.2(C-5),29.1(C-6),29.1(C-7),28.9(C-8),28.8(C-9),28.5(C-10)。以上数据与文献一致,故鉴定为3,4-亚甲二氧基肉桂酸。

4抗肿瘤活性

选取3种常见的肿瘤细胞株，对化合物5、6进行抗肿瘤活性测试。取对数生长期的人前列腺肿瘤细胞株PC3、人肺癌肿瘤细胞株A549、人乳腺癌肿瘤细胞株MCF7，加入适量0.25%的胰蛋白酶消化后，用DMEM培养液配成1×105/mL细胞悬液，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养24h后，吸去上清液，加入不同质量浓度的化合物，别为200、67、22、7.4、2.5、0μmol/L,作为实验组；加入100μL5%DMEM培养液，作为空白组,每组3孔，继续培养48h。实验结束前4h，每孔加入20μLMTT(5mg/mL，用PBS缓冲液配置)，37℃继续培养4h，弃去上清液,加入100μL/孔DMSO,振荡混匀后,在570nm波长处测定OD值,计算抑制率,公式为抑制率=[(1-平均OD值实验组/平均OD值对照组)]×100%。

以阿霉素(DOX)作为阳性对照，化合物5～6对3株肿瘤细胞(PC3、A549、MCF7)的细胞毒性见图1。结果表明,化合物5对肿瘤细胞生长有明显的抑制作用，而化合物6作用较弱。

5讨论与结论

胡椒属为胡椒科中最大的属。国内外对该属植物的化学成分和药理作用作了大量的研究，发现其中含有生物碱、黄酮、木脂素、挥发油及脂肪酸类等多种成分。本研究从荜茇根中分离鉴定了10个化合物，化合物3～4、7～10为首次从荜茇根中分离得到，其中甾体类1个、糖苷类1个、有机酸类3个、生物碱类5个。近年来研究表明酰胺类生物碱是胡椒属植物的主要生物碱成分。本研究发现胡椒碱为荜茇根中的主要成分，其化学结构为桂皮酰胺类。研究证明此类化合物具有消炎止痛、抗惊厥、镇静、抗抑郁等作用。通过抗肿瘤活性测试，表明荜茇酰胺有显著的抗肿瘤活性，可弥补荜茇根化学成分研究的不足，有利于将其开发成抗癌的天然药物或保健产品。

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