板栗壳原花青素稳定性、结构分析及体外消化（一）

板栗属壳斗科栗属坚果类植物，在世界范围内被作为重要的农作物之一。板栗深加工过程中产生大量的板栗壳仍以燃烧和自然腐烂等方式处理，这样既造成了资源浪费也不利于环保。据资料显示，板栗壳中含有色素、有机酸、多酚类、多糖(或苷类)和鞣质等化学成分。板栗壳的多酚类物质主要组分为单宁，而单宁的种类包括很多，其中具有抗氧化活性结构的主要成分为鞣花单宁和原花青素。人体内的自由基过剩会引起多种疾病，包括心血管疾病、白内障、阿尔茨海默氏症等，但是体内的内源性抗氧化物质不足以防御细胞损伤，所以从食物资源中寻找天然抗氧化剂已成为研究热点。有研究表明板栗壳原花青素具有抵御自由基、抑菌杀菌等作用，可以广泛应用于食品及调味品行业。丁培峰研究了茶多酚在酱油中的防腐效果，结果显示，茶多酚与纳他霉素复配使用后与山梨酸钾具有等同的防腐效果，且安全性大大提升。同时，茶多酚具有一定的保健功效，可提高酱油的营养价值和保健功能。

多酚类物质虽然具有多种生理活性和延长调味品保质期的效果，但是外界条件也会影响其稳定性，从而降低它的生理活性，且人体中的胃液及肠道消化液也会对多酚的活性产生影响。例如，提取自姜黄根茎的多酚类化合物姜黄素的药理作用广泛，毒性小，并且长期以来作为调味品和食品添加剂在国内外广泛应用，但是，由于其生物利用度低显著影响其应用价值。目前对板栗壳原花青素的研究主要在抗氧化性及提取优化等方面，对其作为调味品功能性添加剂的开发以及其在人体中的消化吸收研究较少。因此，本实验探究影响板栗壳粗提物中原花青素稳定性的因素，利用HPLC-MS研究其种类并进行结构表征，同时通过人体体外消化模型研究其消化情况，为板栗壳中天然抗氧化剂的开发及其在食品和调味品方面的应用提供一定的参考依据。

一、材料与方法

1、材料与试剂

板栗：取自山东祁蒙山。

香草醛、α-淀粉酶、胆汁提取物、胰蛋白酶、胃蛋白酶：国药集团化学试剂有限公司；标准品表儿茶素、没食子酸、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯以及表没食子儿茶素没食子酸酯：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

2、仪器与设备

TG16-WS离心机长沙湘智离心机仪器有限公司；UV-1800紫外可见光分光光度计上海美诺达仪器有限公司；pH计梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；Agilent1100LC-MSD/TOF高分辨液相质谱联用仪美国安捷伦科技公司。

3、试验方法

（1）板栗壳粗提物提取制备

将板栗壳洗净晾干，粉碎过40目筛得到板栗壳粉末。参考苏云霞等研究得到的最佳提取工艺，取适量板栗壳粉末加入70%乙醇水溶液，使料液比为1∶15(g/mL)，在65℃的条件下提取90min，再将提取液进行真空抽滤，滤液在40℃下真空浓缩，再次冷冻干燥，低温保存备用。

（2）板栗壳粗提物中原花青素稳定性影响因素研究

①板栗壳原花青素溶液的制备

称取板栗壳粗提物0.1g，用蒸馏水定容至100mL，研究光照、温度、金属离子和pH对原花青素的影响。

②光照对板栗壳原花青素的影响

取10mL板栗壳原花青素溶液3份，分别置于室温光照、室温避光和低温避光的条件下，放置4d，每隔1d取样测定样品溶液中原花青素含量(以保存率表示)；原花青素保存率=样品待测时原花青素含量/样品初始原花青素含量×100%。原花青素的测定方法采用硫酸-香草醛比色法。

③温度对板栗壳原花青素的影响

取10mL板栗壳原花青素溶液6份，分别在40，50，60，70，80，90℃条件下恒温水浴2h，原花青素含量测定方法同上。

④pH对板栗壳原花青素的影响

取10mL板栗壳原花青素溶液14份，用HCl和NaOH溶液配制成pH为1～14的溶液，将原花青素样品与10mLpH为1～14的溶液混合，密封静置6h，原花青素含量测定方法同上。

⑤金属离子对板栗壳原花青素的影响

配制0.02mol/L含Fe³⁺、Fe²⁺、Ba²⁺等金属离子的溶液待用，再把不同金属离子溶液与原花青素溶液等体积混合，密封放置一段时间，观察溶液颜色变化。

（3）板栗壳原花青素结构分析

用高效液相测定没食子酸、没食子儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯6种标准品及板栗壳粗提物出峰时间，比较得出板栗壳粗提物中所含物质，并对粗提物进行高分辨质谱结构分析。

色谱条件：色谱柱为DIONEXC₁₈(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：甲醇(B)(体积分数为0.05%)-三氟乙酸(A)，梯度洗脱：0～12min，A：87%～75%，B：13%～20%；12～23min，A：75%～20%，B：25%～80%；23～26min，A：87%，B：13%。流速：0.5mL/min；检测波长：280nm；柱温：35℃；进样量：20μL。

质谱分析条件：色谱柱为LichrosphersC₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)；质谱进样分流比为1∶1；负离子模式；离子化方式：ESI；扫描范围：m/z50～2000；干燥气温度：350℃；干燥气流速：15L/min；喷雾压力：40psi；毛细管电压：3500V。

（4）板栗壳原花青素的消化吸收

①消化体系的制备

胃液环境配制：在250mL烧杯中加入0.4g的胃蛋白酶、9mg/mL的氯化钠溶液90mL混匀，再转入100mL的容量瓶中，用1mol/L盐酸调节使溶液pH为2～2.3，直至溶液至容量瓶刻度线。

肠道环境配制：在250mL烧杯中加入225mg的胰蛋白酶、225mg的胆汁提取物、9mg/mL的氯化钠溶液90mL混匀，再转入100mL的容量瓶中，用1mol/L氢氧化钠调节使溶液pH为7～7.2，直至溶液至容量瓶刻度线。

②模拟胃液消化

设置5组平行试验和1个空白对照，每组平行实验条件如下：在50mL锥形瓶中依次加入中口腔消化液4mL、胃消化液16mL，于37℃、转速为250r/min的摇床中震荡反应2h，每0.5h测1次pH值，通过测pH的变化可初步判断原花青素是否消化；并在反应时间为0.5，1，1.5，2h各取1mL消化液，测定原花青素的含量，并计算其消化率；消化率=(1-测得原花青素质量/最开始加入原花青素质量)×100%。

③模拟肠道消化

设置5组平行试验和1个空白对照，每组平行实验条件如下：量取胃液消化液20mL，用氢氧化钠中和到pH为7，终止胃液消化反应；再加入20mL肠道消化液反应2h，并在反应时间0.5，1，1.5，2h各取1mL消化液测定原花青素的含量，并计算其消化率。

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