铁皮石斛多糖提取及抗氧化活性研究（一）

铁皮石斛为兰科石斛属植物铁皮石斛的新鲜或干燥茎，其为药食两用植物。长期以来，许多东方国家将石斛用于草药制剂中，而在中国已经发现了超过60种石斛。铁皮石斛具有很好的抑制衰老、抑制肿瘤、抗氧化、提高机体免疫能力的功效，并且可用于肿瘤、糖尿病、慢性咽炎胃炎、机体免疫下降等的辅助治疗。生物碱类、多糖类、菲类等物质为铁皮石斛的主要化学成分，其中多糖是其主要有效成分且较之生物碱和菲类，多糖含量较高。

近年来，人们对多糖的功效认知逐渐增多，铁皮石斛多糖的研究也越来越多。尚喜雨用水提法、酶法对铁皮石斛多糖的提取进行了研究，分别得到最佳提取条件后，以最佳提取条件进行提取并比较提取得率，结果水提法的多糖平均提取率为12.07％，酶法的多糖平均提取率为20.84％。何铁光等从铁皮石斛原球茎中提取得到多糖DcPPla-1，并研究了DCPPla-1对羟基自由基和超氧阴离子的清除作用，发现多糖DCPPla-1对二者的清除作用均比较明显，同时多糖DcPPla-l对由Fe²⁺和H₂0₂诱导的小鼠肝组织脂质过氧化具有极显著的抑制作用(P＜0.01)。查学强等研究了铁皮石斛多糖对超氧阴离子自由基、羟基自由基的清除作用及对烷基自由基引发的亚油酸氧化体系的抑制作用，结果表明，多糖对超氧阴离子自由基、羟基自由基具有不同程度的清除作用，对烷基自由基引发的亚油酸氧化体系有显著的抑制作用。

本文采用正交试验方法，确定铁皮石斛多糖的最佳提取工艺条件。并通过测定铁皮石斛多糖对1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、超氧阴离子(02-)、羟基自由基(-OH)的清除能力以及铁皮石斛多糖对三价铁的还原能力来研究其抗氧化活性。

一、材料与方法

1、实验材料与试剂

铁皮石斛干燥茎由江苏益斛生物科技有限公司提供；无水乙醇、正丁醇、氯仿、石油醚等均为分析纯，DPPH、水杨酸、抗坏血酸、双氧水、铁氰化钾等均为分析纯化学试剂，均由天津江天化工有限公司提供。

2、实验仪器与设备

主要仪器设备有HW-SY型电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司)；TGL-16B型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-Ⅲ型循环水真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；LGJ-0.5型冷冻干燥机(军事医学科学院实验仪器厂)；Model680型酶标仪(ThermoElectronU.S.A)。

3、实验方法

（1）铁皮石斛多糖的提取

将干燥的石斛茎粉碎，过筛。称取10g粉末，用石油醚在80℃下回流提取3h进行脱脂，然后过滤。滤渣继续用无水乙醇回流提取3h进行脱色，过滤并干燥，加入适量体积倍数的蒸馏水在恒温水浴锅中提取多糖，得到多糖提取液，进行多次提取，提取液合并浓缩；采用Sevag试剂脱蛋白5次，然后旋蒸除去Sevag试剂；水层用去离子水透析24h，再加入4倍体积的无水乙醇沉淀；离心后，沉淀物依次用乙酸乙酯和丙酮洗涤，沉淀溶解在水中并冻干，得到铁皮石斛多糖。多糖得率计算公式：

多糖得率(％)=(铁皮石斛多糖质量／铁皮石斛粉末质量)×100

(2)单因素试验和正交试验

以铁皮石斛多糖的提取得率为评价指标，考察热水浸提中提取时间、料液比、提取温度、提取次数四个因素对铁皮石斛多糖提取的影响。根据单因素试验的结果确定各个因素的水平范围并以此进行正交试验。

(3)铁皮石斛多糖对DPPH清除能力的测定

根据Sllimada等的方法测定铁皮石斛多糖的DPPH清除能力，并进行了一些修改。将多糖样品配制成浓度梯度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0m咖L的多糖溶液，然后准确吸取2.0mL多糖溶液加入到由铝箔覆盖的试管中，再分别加入0.2mmol／L的DPPH-乙醇溶液2.0mL，剧烈振荡、混匀，避光反应30min。在517nm处测定其吸光度值，每个样品浓度测定三组平行。同时用维生素C溶液作阳性对照。
DPPH自由基清除活性(RSA)计算公式如下：
 

式中：A₁为DPPH-乙醇溶液和蒸馏水的吸光度值；

A₂为样品溶液和无水乙醇溶液的吸光度值；

A₃为DPPH-乙醇溶液和样品溶液的吸光度值。

（4）铁皮石斛多糖对超氧阴离子清除能力的测定

根据查学强和王丽霞等的方法测定铁皮石斛多糖对超氧阴离子的清除能力，并进行了部分修改。将多糖样品配制成浓度梯度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg／mL的多糖溶液，将pH为8.2的50mmol／L的Tris-HCl缓冲液在25℃下预热20min，然后吸取Tris-HCl缓冲液2.0mL和0.5mL多糖溶液混匀，立即加入1.0mL7mmo儿的邻苯三酚溶液，迅速摇匀，在25℃下反应5min，在325nm处测定其吸光度值，每个样品浓度测定三组平行。同时用维生素C溶液作阳性对照。

超氧阴离子清除活性(RSA)计算公式如下：

（5）铁皮石斛多糖对羟基自由基清除能力的测定

根据smironoff和wang等提出的方法测定铁皮石斛多糖对羟基自由基的清除能力，并加以改进。将多糖样品配制成浓度梯度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg／mL的多糖溶液，然后吸取2.0mL多糖溶液与2.0mL9mmol／L的Fes0₄和2.0mL9mmol／L的水杨酸-乙醇溶液，混合，静置10min，加入2.0mL8.8mm01几的H₂0₂，在37℃下反应30min，在510nm处测定其吸光度值，每个样品浓度测定三组平行。同时用维生素C溶液作阳性对照。

羟基自由基清除活性(RSA)计算公式如下：

式中：A₁为不加样品的溶液的吸光度值；

A₂为不加水杨酸-乙醇的溶液的吸光度值；

A₃为样品溶液的吸光度值。

（6）铁皮石斛多糖还原能力的测定

根据文献所述方法测定铁皮石斛多糖的还原能力，并进行一些修改。将多糖样品配制成浓度梯度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg／mL的多糖溶液，将1.0mL多糖溶液、2.5mLpH为6.6的0.2mol／L磷酸盐缓冲液、2.5mL1％铁氰化钾溶液混合，在50℃水浴中反应20min后加入2.5mL10％的三氯乙酸，摇匀后离心(400r／min)。吸取2.5mL上清液，然后加入2.5mL蒸馏水、6.5mL0.1％氯化铁溶液，静置反应10min，在700nm处测定其吸光度值，每个样品浓度测定三组平行。同时用维生素C溶液作阳性对照。以吸光度值表示其还原能力。

二、结果与分析

1、正交试验结果

根据单因素试验确定的各因素水平范围得到正交因素水平表，如表1所示。根据因素水平表进行L₉(3⁴)正交试验，试验结果如表2所示。正交试验方差分析结果如表3所示。

根据表2中的R值可知R_A＞R_B＞R_C＞R_D，则四个因素对多糖提取得率影响由大到小为提取时间＞料液比＞提取温度＞提取次数。根据K值确定各因素最佳水平，考虑到试验所需的时间、原料等因素，确定提取次数为3次。最终得到铁皮石斛多糖提取的最佳提取条件为A₂B₃C₂D₂，即提取时间2h，料液比1:80，提取温度80℃，提取次数3次。由表3方差分析结果可知通过在0.05显著水平上的检验，提取时间和料液比两种因素对铁皮石斛多糖提取得率有显著影响。

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