羧甲基川木瓜多糖的制备及对α-葡萄糖苷酶的抑制作用(一）

糖尿病为一种以高血糖为特征的代谢性疾病，近年来发病率持续上升。糖苷酶抑制剂被称为治疗糖尿病的第四类药物，可以延缓单糖吸收，降低餐后高血糖，使胰岛素的分泌得到改善。目前葡萄糖苷酶抑制剂的来源主要有3种途径：化学合成、植物提取、微生物发酵。植物来源的葡萄糖苷酶抑制剂，具有治疗作用温和持久、副作用小、可长期使用等特点。

目前从植物中提取得到的葡萄糖苷酶抑制剂主要有：黄酮、生物碱、萜类、酚类、多糖等。研究发现，多种植物多糖有抑制α-葡萄糖苷酶的作用，但部分天然多糖的活性与已用于临床的糖苷酶抑制剂有一定的差距。化学修饰是改善活性的有效途径之一，通过对多糖残基上的羟基、羧基、氨基等基团进行修饰，可能会增强活性或产生新的活性。
川木瓜为蔷薇科木瓜属植物贴梗海棠的成熟果实。广西百色市凌云县有丰富的川木瓜资源，其花可作有较好的观赏价值，果实即可食用又可药用，有“百益之果”的美称。川木瓜作食用，含有氨基酸、矿物质、维生素等；作药用，有软化血管、降糖、降压、提高人体免疫力和护肝降酶等功效。

目前国内外对川木瓜的活性的研究主要集中在有机酸、三萜和黄酮类物质上，对川木瓜多糖的研究相对较少。课题组研究发现，川木瓜多糖具有抑制α-葡萄糖苷酶的作用，川木瓜多糖进行羧甲基化修饰可以增强对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。不同条件下羧基甲化的产物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用有较大的差异。本试验先优化羧甲基化反应的工艺条件，再测试不同取代度的羧甲基多糖抑酶活性，旨在得到具有较好抑酶活性的羧甲基化川木瓜多糖。

一、材料与方法

1、材料、试剂与仪器

材料：川木瓜购于广西百色市凌云县，切片、晾干、粉碎过筛备用。

试剂：木瓜蛋白酶；4-硝基酚-2-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）；α-葡萄糖苷酶；阿卡波糖；乙醇、氯乙酸、异丙醇、氢氧化钠等其余试剂均为分析纯。

分析纯。仪器：E-201-C型pH复合电极；CPA64型电子天平；UV-1750紫外可见分光光度计；640一IR傅利叶变换红外光谱仪；SMARllAB3Kwx-衍射仪；RE-52AA型旋转蒸发仪；HitachiSU8220扫描电镜；m-lA-50真空冷冻干燥机；HHS-21-4电热式恒温水浴锅。

2、方法

（1）川木瓜多糖的提取及纯化工艺流程

川木瓜粉末→石油醚回流脱脂→85％乙醇回流除去色素、低聚糖等小分子→抽滤→烘干滤渣→加入蒸馏水浸提2次→减压浓缩多糖提取液→乙醇沉淀→离心分离得粗多糖→木瓜蛋白酶脱蛋白→Sevag法脱蛋白→活性炭脱色素→多糖液浓缩→乙醇沉淀→离心分离→冷冻干燥→得精制多糖。

（2）羧甲基川木瓜多糖的制备

①单因素试验

采用氢氧化钠-氯乙酸法制备羧甲基川木瓜多糖。称取0.50g精制川木瓜多糖于三口瓶中，加入50mL异丙醇，在常温下搅拌20min，缓慢加入一定浓度的NaOH溶液10mL，继续搅拌40min，将一定质量氯乙酸加入反应体系中，升温至一定温度水浴反应一段时间，反应完成后，冷却至室温，用稀盐酸调pH至中性，装人透析袋中，用蒸馏水透析48h，减压浓缩多糖溶液，用3倍90％乙醇沉淀多糖，离心分离，冷冻干燥，得羧甲基川木瓜多糖，取少量样品测取代度。以NaOH用量、氯乙酸用量、反应温度、反应时间为单因素，研究各因素对取代度的影响。

②正交试验

根据单因素试验结果，选取NaOH用量、氯乙酸用量、反应温度、反应时间为考察因素，以羧甲基川木瓜多糖的取代度为制备指标，进行L9（34）正交试验，优化羧甲基川木瓜多糖的制备工艺，正交试验因素水平设置见表1。

（3）取代度测定

羧甲基川木瓜多糖的取代度参照文献进行测定。精确称取0.05g羧甲基川木多糖，溶于标准盐酸溶液中，置磁力搅拌器中搅拌溶解，用标准氢氧化钠溶液滴定，分别记下pH为2.1和4.3时消耗的NaOH溶液体积V₁、V₂，取代度按下式计算。

式中：DS为取代度；

m为羧甲基川木多糖的质量；

c为标准氢氧化钠溶液的浓度。

（4）红外光谱分析

取少量干燥的川木瓜多糖、羧甲基川木瓜多糖样品与溴化钾粉末混合研磨后压片，用红外光谱仪在4000～400cm^-1范围内扫描。

（5）扫描电镜形貌分析

取少量干燥的川木瓜多糖与羧甲基川木瓜多糖样品放样品台上，置离子溅射仪中镀导电金膜，在5kV高压下分别观察不同放大倍数下的表面结构。

（6）X衍射分析

取少量干燥的川木瓜多糖、羧甲基川木瓜多糖样品在X-射线衍射仪上测量X-射线的强度，扫描角度为5～90，扫描速度为7⁰／min。

（7）不同取代度羧甲基川木瓜多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

分别选取低、中、高3种取代度的羧甲基川木瓜多糖测定抑制α-葡萄糖营酶的活性，以PNPG为底物，用比色法测试抑制作用。在具塞比色管中试管中加入2mLpH为6.8磷酸盐缓冲溶液，0.2mL0.1U／mL的。α-葡萄糖苷酶，羧甲基川木瓜多糖溶液lmL，混匀后置37℃水浴15min，再加入20mmol／LPNPG0.3mL启动反应，在37℃继续反应20min，加入2mL0.1mol／LNa₂C0₃终止反应，测定400nm处吸光度值。每个样品重复3次，取平均值，按下式计算抑制除率。

抑制率％=[Ao-（A₁—A₂）]／Ao×100

式中：Ao为磷酸缓冲液代替多糖溶液的吸光度；

A₁为加入多糖溶液后的吸光度；

A₂为磷酸缓冲液代替PNPG的吸光度。

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