嗜热小孢根霉家族甘露聚糖酶基因的克隆表达

β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）是一类作用于β-1,4-甘露糖苷键的内切水解酶，广泛分布于软体动物、植物和微生物中，其中微生物来源的甘露聚糖酶资源最为丰富。作为一种新兴的食品加工用酶，甘露聚糖酶可应用在寡糖的制备、面包品质的改良、乳制品增稠加工及果汁饮料稳定性等领域。目前，GH5家族和GH26家族来源的甘露聚糖酶被进行了广泛研究，而另外两个家族，尤其是GH134家族甘露聚糖酶报道的信息较少。本课题组前期探究了GH5家族甘露聚糖酶NsMan5B对果汁澄清效果的评价，发现除橘子汁外，该重组酶对其他果汁的澄清度都有不同程度的提高，其中柿子汁澄清度提高了31.8%，苹果汁、桃汁、葡萄汁的澄清度分别提高7%、4%和4%。而关于GH134家族的甘露聚糖酶在果汁加工的应用还鲜有相关报道。

近日，河北农业大学食品科技学院拟对嗜热真菌小孢根霉（Rm）HBFH10中GH134家族甘露聚糖酶基因进行克隆、表达及酶学性质的研究，探究其在果汁加工过程中的应用潜力。

1 嗜热菌HBFH10的分离及鉴定

从河北省凤来仪酒业有限公司大曲中筛选获得1 株真菌HBFH10，由A、B经菌株生长温度测定结果可知，菌株HBFH10在19 ℃下无法正常生长，而能够在45 ℃条件下正常生长，符合嗜热真菌生长温度特点要求，判定HBFH10菌为嗜热真菌。使用ITS1和ITS4引物进行18S基因间隔区域的扩增，最终获得800 bp左右PCR产物。利用BLAST软件分析发现与Rm strain D4-1（GQ502280.1）一致性最高，为99%，通过进化树分析菌株HBFH10属于Rm，最终将该菌命名为Rm HBFH10。

2 甘露聚糖酶RmMan134基因序列分析

经对多条GH134氨基酸序列对比发现，该家族甘露聚糖酶存在2 个保守区域。保守I区序列（NFGIFKQNW），活性催化位点位于该区域中，该区域结构主要为Loop结构，由于Loop结构具有较强的柔性特点，这为底物的识别及催化提供了便利；保守II区序列（DDTRFWVD），该区域相对而言最为保守，该区域主要是β折叠片结构。在上述两区域设计GH134家族的兼并引物。本研究利用兼并引物Man134UF和Man134UR对Rm HBFH10基因组DNA进扩增，获得1 个基因保守片段，测序结果表明该基因为GH134家族的甘露聚糖酶基因的部分序列，并且与菌株Rm ATCC 52813基因组中的假使蛋白基因（CEG81741.1）序列一致性为98%。进一步分析发现RmMan134基因由552 bp碱基组成，没有内含子序列，编码183 个氨基酸和1 个终止密码子。

RmMan134基因与已报道的GH134家族甘露聚糖酶的一致性对比分析，该基因与已报道GH134家族基因的氨基酸序列一致性较低（＜69.6%），表明RmMan134基因具有一定的新颖性，具有理论研究价值。其中与甘露聚糖酶AoMan134（XP_023093135.1）一致性为45.2%，与甘露聚糖酶SsMan134（PDB，5JTS）一致性为51.6%，与甘露聚糖酶RmMan134A（MF538624）一致性为69.6%，与甘露聚糖酶AnMan134（ANID_02710）一致性为51%。RmMan134具有α/β结构，属于Clan-A超家族，含有催化保守氨基酸（E55和D67），分别位于第2个和第3个α螺旋结构中。

3 重组菌RmMan134基因诱导表达及产物的SDSPAGE分析

表达质粒pPIC9k-RmMan134经Bgl II限制酶线性化后，电击转入毕赤酵母GS115感受态细胞，在MD平板上培养，挑取48 个转化子进行小管诱导，毕赤酵母采用两段法进行异源基因诱导表达。从48 个转化子中筛选得到32 株具有甘露聚糖酶活力的转化子。将重组菌株进行诱导表达之后，对细胞发酵液进行酶活力检测，发酵液中酶活力为7.8 U/mL。发酵酶液800 mL经12 000×g离心10 min去除酵母细胞及培养基，收集上清液，之后将上清酶液进行膜包（10 kDa）浓缩处理，使浓缩后的酶液为30 mL左右。如SDS-PAGE检测重组酶RmMan134表观分子质量约为22 kDa，比理论分子质量18.5 kDa偏大，经糖基化预测分析发现RmMan134酶蛋白分子存在1 个N-糖基化位点（NKSG）。

4 重组菌RmMan134酶学特性分析

重组酶 RmMan134的最适反应温度为 5 0 ℃，该酶的反应温度范围较广，30～80 ℃都能够检测到该酶活力，在70 ℃反应下具有30%以上酶活力，在80 ℃时能够维持20%以上活力。

重组酶RmMan134具有较广的pH值作用范围，在pH 2.0～11.0范围内都表现出一定的酶活力，该酶的最适反应pH 6.0，在酸性范围内（3.0＜pH＜7.0）酶活力较高，能够维持60%以上酶活力。随着pH值的逐渐升高，酶活力也随之降低。

分析重组酶 RmMan134的热稳定性研究发现，在50 ℃条件下，重组酶RmMan134处理1 h后，能够维持60%以上酶活力；而60 ℃处理1 h后，酶活力损失约60%。分析其pH值耐受性发现，该酶在pH 4.0～8.0范围内处理1 h后酶活力基本维持稳定，即使在碱性条件下（7.0＜pH＜11.0）依然能够维持75%以上酶活力，而在强碱条件下，重组酶极不稳定，酶活力丧失较明显。

将重组酶RmMan134对角豆胶活性定义为100%，则对底物魔芋胶、果胶、CMC-Na和木聚糖的活力分别为114.8%、44.9%、7.2%和19.6%。以魔芋胶为底物时，设定底物质量浓度的倒数（1/[S]）为横坐标，以反应速率倒数（1/V）为纵坐标，获得双倒数曲线：Y=0.0116X＋0.0175，R2=0.998，计算酶的动力学参数V max为57.1 μmol/（min·mg），Km为0.66 mg/mL。

5 重组菌RmMan134对5种果汁的影响

除了杏汁和葡萄汁外，重组酶RmMan134对其他果汁的澄清度都有不同程度的提高，其中橙汁提高的最为明显，提高了23.8%。其次苹果汁提高了11%，桃汁提高了7%左右。在酶解杏汁和葡萄汁时，很有可能是杏汁和葡萄汁中的单宁及多酚物质与重组酶RmMan134交联在一起，影响了果汁的澄清度。除此之外，重组甘露聚糖酶的添加使得葡萄汁出汁率提高了7%左右，而重组酶并未增加上述5 种水果的总还原糖量。

6 讨论

本研究成功从浓香大曲中筛选获得了1 株嗜热真菌HBFH10，经鉴定为Rm。目前，微孢根霉菌种在食品生产中起着重要作用，已从Rm中获得了淀粉酶、植酸酶酶和脂肪酶等。本研究从嗜热真菌Rm HBFH10中克隆得到一个新的甘露聚糖酶基因（RmMan134）。

甘露聚糖酶分为GH5、GH26、GH113和GH134家族，GH113家族甘露聚糖酶的分布极其有限，继而限制了该家族酶的进一步挖掘。GH134家族的酶氨基酸序列长度非常短，一般长度为180 aa左右，远低于其他3 类家族的300～500 aa，这一特点使得只需要30%左右的氨基酸材料就可以合成出所需要的甘露聚糖酶，在本研究中，甘露聚糖酶RmMan134除含有GH134家族的催化结构域外，还含有一个18 aa组成的信号肽序列，这使得该蛋白可以分泌到细胞之外参与糖类的代谢活动。经多条序列比对分析发现，GH134家族甘露聚糖聚糖酶N端往往含有信号肽序列特征，与GH5和GH26家族相似，这也说明该类家族也很有可能在微生物中广泛分布。

重组酶RmMan134的最适pH值为6.0，这与GH134家族其他 β - 甘露聚糖酶最适 p H 值十分相似，同样来源Rm的甘露聚糖酶RmMan134A的最适pH值为5.0，在pH 7.0～11.0碱性条件下往往表现出非常低的酶活力，甚至会丧失全部酶活力，而对于甘露聚糖酶RmMan134来说，依然能保持20%～70%以上酶活力，同样的差异与Streptomyces sp. NRRL B-24484的甘露聚糖酶也比较明显。

RmMan134更适合在中性pH值环境发挥作用，这两个同功酶的存在使得Rm对环境具有较强适应能力。RmMan134与RmMan134A具有相同的最适温度（50 ℃）。进一步分析发现，RmMan134较RmMan134A具有较高的酶反应温度和较好的热稳定性。在反应温度为80 ℃时，RmMan134表现出20%酶活力，而RmMan134A则丧失酶活力。且酶热稳定性能的差异依然明显，RmMan134在60 ℃条件下处理30 min依然可以维持50%左右酶活力，而RmMan134A酶活力基本消失。重组酶RmMan134是目前GH134家族反应温度最高的酶，但随着研究的进一步深入，GH134家族来源的嗜热甘露聚糖酶应该很快会被挖掘出来。

甘露聚糖酶可有效的降解甘露聚糖，目前已成为果汁加工中一种新型酶制剂而被加以利用，鉴于GH134家族甘露聚糖酶的最适底物为葡甘露聚糖，因此推测很可能是水果中甘露聚糖种类造成了重组甘露聚糖酶RmMan134A对不同果汁澄清效果的差异，其中对橙汁的澄清效果最为明显，使橙汁澄清度提高了约76%，优于来自Lactobacillus casei HDS-01甘露聚糖酶的澄清效果，相似的差异在P. acidilactici（M17）来源的甘露聚糖酶也有所体现。分析发现L. casei HDS-01菌的甘露聚糖酶属于GH26家族，而GH26家族和GH134家族采用不同的催化机制，同时作用底物也存在差异，这很可能是造成上述差异的主要原因，而更信服的结论仍需进一步进行研究。

7 结论

本研究成功从浓香大曲中筛选出嗜热真菌RmHBFH10，并从该菌中挖掘到了1 个假使蛋白，经分析为新型GH134家族甘露聚糖酶（RmMan134）。研究发现，重组甘露聚糖酶RmMan134在pH 6.0和50 ℃下表现出了最佳活性，并且在从酸性到碱性的广泛pH值范围内具有较高活性（2.0～11.0），在宽泛pH值范围内和在50℃条件下具有出色的稳定性。另外，重组酶RmMan134可以有效地澄清橙汁、桃汁和苹果汁，其中可使橙汁的澄清度提高约76%。

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