超高效液相色谱法同时测定饮料中的10种食品添加剂（一）

在饮料加工行业中，通常加入各种食品添加剂用以改善饮料的口感、品质和色泽，并可延长保质期。饮料中常见的食品添加剂包括甜味剂(糖精钠)、人工合成色素(日落黄、亮蓝、苋菜红、诱惑红、胭脂红、柠檬黄)、防腐剂(山梨酸、苯甲酸)及咖啡因等。尽管我国国家标准中已经明确规定了食品添加剂允许使用的范围和用量，但长期、大量食用含有食品添加剂的饮料，同样会对人体健康造成一定的风险。因此，检测饮料中多种食品添加剂的含量对保障食品安全具有重要意义。

近年来，同时检测多种食品添加剂的方法越来越多，常用的检测方法有高效液相色谱法、薄层色谱法、质谱联用法、气相色谱法、极谱法等。然而，对于多组分混合物的分析，大部分方法均存有一定的局限性。如薄层色谱法测定多组分混合物时，操作步骤繁琐，且定量准确度较差；色谱一质谱联用法虽然在分辨率和灵敏度方面有一定优势，但其仪器昂贵、不易普遍推广；极谱法易受多种干扰因素的影响，定性较为困难；液相色谱法是目前应用最广泛的分析方法，但传统的液相色谱法对于同时检测多组分混合物时，分析耗时长、进样量大、检测效率低。

本研究利用超高液相色谱技术同时快速检测日落黄、亮蓝、苋菜红、诱惑红、胭脂红、柠檬黄、山梨酸、苯甲酸、糖精钠及咖啡因等10种食品添加剂，可大幅度增强多种组分的分离能力，提高了分析速度及灵敏度，为食品安全的检测提供了必要的技术支持。

一、实验部分

1、主要仪器和试剂
仪器：超高效液相色谱仪[watersAcquiryH-Class，配二极管阵列检测器(PDA)，Empower3色谱工作站]；ACQUITYUPLCBEHC18(2.1mm×50mm,1.7μm)；紫外可见分光光度计(SP-1900UV)；中文液晶超声波清洗器(昆山美美超声仪器有限公司)；TB-214型1/万分之一电子天平(北京赛多利斯)；高速冷冻离心机(T11eIulloFisher)；超纯水机(Millipore公司)；0.22μm微孔滤膜过滤器。

标准品：日落黄、亮蓝、苋菜红、胭脂红、柠檬黄、咖啡因标准品浓度均为0.5mg/mL，诱惑红、混合溶液(苯甲酸、山梨酸、糖精钠)标准品浓度均为1.0mg/mL，均购白中国计量科学研究院。

试剂：乙酸铵(优级纯、CNWAmmoniumacetateforHPLC)；甲醇(色谱纯、美国MERCK公司)；乙腈(色谱纯、美国MERCK公司)；实验用水均由Milli-Q超纯水机制取。50μg/mL10种添加剂混合标准储备液配置：分别准确吸取2.5mL浓度均为0.5m∥mL的日落黄、亮蓝、苋菜红、胭脂红、柠檬黄、咖啡因标准品及1.25mL浓度均为1.0mL诱惑红、混合溶液(苯甲酸、山梨酸、糖精钠)标准品于25mL容量瓶中，用水定容至刻度。

混合标准系列：准确吸取一定体积的混合标准储备液(50μg/mL)分别配制成质量浓度为0、0.05、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、50.0μg/m标准溶液系列。

2、色谱条件

色谱柱为ACQUITYUPLCBEHC18(2.1mm×50mm，1.7μm)，柱温30℃，进样量：3μL，流速为0.15mL/min，检测波长为230nm。流动相分别为甲醇(A)和0.02mol/L乙酸铵(B)，流动相的梯度洗脱程序如下表所示：

二、结果与讨论

1、实验条件的优化

（1）色谱柱的选择
本试验考察了色谱柱ACQUITYUPLCBEHC18(2.1mm×50mm，1.7μm)与色谱ACQUITYUPLCBEHC18(2.1mm×100mm,1.7μm)的分离效果。结果表明，选择柱长为100mm的色谱柱时，各组分出峰时间延长，并且色谱峰响应值低；而选择柱长为50mm色谱柱时，所有组分混合物可在10min内满足快速分离的需要，所得峰形尖锐且分离度好。因此，本试验选择ACQUITYUPLCBEHC18(2.1mm×50mm，1.7μm)作为方法最佳色谱柱。

（2）检测波长的选择

用紫外-可见分光光度计在200～800nm波长处对10种食品添加剂进行扫描，用水作参比。

其主色峰：柠檬黄428nm、日落黄475nm、诱惑红506nm、胭脂红511nm、苋菜红522nm、亮蓝637nm、苯甲酸228nm、山梨酸248nm、糖精钠251nm、咖啡因273nm，可初步定性判定10种食品添加剂在紫外-可见分光光度计的最大吸收波长。再利用UPLC-PDA检测器在200～600nm波长范围内对混合标准溶液进行扫描，发现在230nm波长处10种食品添加剂分离度好、灵敏度高，故最终选择230nm作为检测波长。

（3）流动相的选择

本试验分别考察乙腈/甲醇-乙酸铵缓冲液，乙腈/甲醇-磷酸二氢钾缓冲液，乙腈/甲醇-水缓冲液作为流动相体系的分离效果。结果表明，当流动相为甲醇-乙酸铵缓冲液时，10种目标物实现完全分离，同时本试验对乙酸铵溶液浓度分别为10、20、40mmol/L进行了比较。结果表明，当乙酸铵浓度小于20mmol/L时，苯甲酸和山梨酸色谱峰得不到完全分离，亮蓝和咖啡因色谱峰重叠在一起(见图3a)；当乙酸铵浓度大于20mmol/L时，各组分分离度差，影响方法难以定性(见图3b)。此外，当流动相中盐类溶液浓度过高，容易引起UPLC色谱柱堵塞，影响色谱柱的柱效。所以本试验选用甲醇-20mmol/L乙酸铵溶液作为流动相体系，不仅可以改善分离效能，还能够达到缩短检测时间的目的。

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