蛋白酶酶解红花籽粕的工艺条件研究（一）

红花，为一年生草本菊科红花属植物，植株呈冠状，主茎强壮，花丝多呈红、桔红、桔黄、黄、浅黄、白等色。种子为瘦果，种皮色分白、灰、黑、黑褐，花期为每年的6～7月份，果期为8～9月份。红花籽粕是红花籽提油后的副产品，榨油后的红花籽粕有两种：即带壳籽粕和去壳籽粕，其中带壳的蛋白质含量为19%，而去壳的蛋白质含量高达40%。即使带壳籽粕的营养价值也可以与苜蓿相媲美，在畜牧业中用作饲料添加，可为肥育牲畜的饲料；而去壳籽粕则更与亚麻子油饼相似，在母鸡饲料中可直接代替蛋白质添加。有报道称，通过对部分市售红花籽粕的研究，营养指标测定如下：其中粗蛋白质20%、粗纤维31%、粗蛋白消化率78%、粗纤维消化率14.3%，由于其消化率较高，特别适用于作为奶牛饲料，对产奶量及品质都有很大程度的提高，是一种非常具有开发价值的副产品；红花籽粕所含蛋白氨基酸属于完全氨基酸，含有人体所需的18种氨基酸，其中8种必需氨基酸含量较高，约占氨基酸总量的30%左右；此外，红花籽粕在农业中可用做抗冻剂、抗虫剂和有机肥料等。

红花籽粕含有丰富的蛋白，其制备成的抗氧化肽具有较强的还原力，国内对红花籽粕蛋白利用研究的比较少，为提高红花籽粕利用前景，本研究选取木瓜蛋白酶，并加入超声辅助水解，对红花籽粕蛋白的提取工艺进行优化，为红花籽粕的综合利用及开发相关高附加值的功能性食品提供技术依据。

一、实验材料与方法

1、材料与仪器

红花籽粕：新疆产地；木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草芽孢杆菌中性蛋白酶：上海多比实业有限公司；三氯化铁、铁氰化钾、30%过氧化氢、硫酸、硼酸、盐酸、磷酸氢二钠、无水乙醇、氢氧化钠、酚酞、三氯乙酸、甲醛、碱性品红、磷酸二氢钠：购于郑州莱博仪器设备有限公司；试剂均为分析纯。UNIVERSAL320高速冷冻离心机：Hettich有限公司；AUY120分析天平：SHIMADZUCORPOPATIONJAPAN；722E可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；ALPHAL-2真空冷冻干燥机：德国M.CHRIST公司；HH恒温水浴锅：江苏金坛中大仪器厂；PHS-25酸度计：上海雷磁仪器厂：C21-IH02E9电磁炉：浙江苏泊尔股份有限公司；YP202N电子天平：上海精密仪器仪表有限公司。

2、实验方法

（1）试剂的配制

pH7.0磷酸盐缓冲液：量取61mL的0.02mol/L磷酸氢二钠溶液和39mL的0.02mol/L磷酸二氢钠，混合均匀，即为pH7.0磷酸盐缓冲液。

0.02mol/L氢氧化钠标准溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于水，定容至100mL。0.05mol/L甘氨酸标准溶液：准确称取375mg甘氨酸，溶解后定容至10mL。400mL中性甲醛溶液：在50mL36%～37%分析纯甲醛溶液中加入1mL0.5%酚酞乙醇水溶液，用0.02mol/L的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。

（2）红花籽粕酶解液的制备

提油后的红花籽粕用高速粉碎机进行粉碎，过50目筛，取2.5g红花籽粕于小烧杯中，加入50mLpH7.0的磷酸缓冲溶液，于水浴锅55℃水解1h，灭酶活（100℃，10min）在10000r/min转速下冷冻离心15min，取上清液，备用。

（3）酶活力的测定

①超声波前后酶活力的测定

准备6支干净的试管，分别取酶液1mL于试管中，木瓜酶液、中性酶液、胰蛋白酶液各两支试管，其中三支作空白对照，另外三支依次加入3mLpH7.0磷酸缓冲液，37℃水浴锅中预热10min，加入pH7.0磷酸缓冲液配制的1%酪蛋白溶液1mL，摇匀，37℃水浴10min或55℃条件下用超声波处理10min，，取出加入10mLTCA（三氯乙酸）溶液终止反应，剧烈摇动，37℃水浴半小时，冷冻离心取上清液作7倍稀释，275nm处测吸光度值A。空白对照：在加入底物之前加入TCA溶液。

②蛋白酶酶活力计算

准备6支干净的试管，分别取酶液1mL于试管中，木瓜酶液、中性酶液、胰蛋白酶液各两支试管，其中三支作空白对照，另外三支依次加入3mLpH7.0磷酸缓冲液，37℃水浴锅中预热10min，加入pH7.0磷酸缓冲液配制的1%酪蛋白溶液1mL，摇匀，37℃水浴10min或55℃条件下用超声波处理10min，，取出加入10mLTCA（三氯乙酸）溶液终止反应，剧烈摇动，37℃水浴半小时，冷冻离心取上清液作7倍稀释，275nm处测吸光度值A。空白对照：在加入底物之前加入TCA溶液。每分钟水解产生1µg酪氨酸所需的酶量，即为1个酶活单位（U）。由酪氨酸标准曲线方程（A=aC+b）及酶活定义推得：

酶活=（A-b）×N/（a·水解时间）（1）

式中N为稀释倍数8；

A为吸光值；

酶活单位为U/mL。

（4）L-酪氨酸标准曲线的建立

准确称取于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1g，用20mL1mol/L盐酸溶解后，再用蒸馏水定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得到100µg/mL的L-酪氨酸标准液。分别吸取100µg/mL的L-酪氨酸标准液0、1、2、3、4、5、6mL于10mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，制成每毫升分别含L-酪氨酸0、10、20、30、40、50、60µg的标准使用液，在275nm下测定各浓度酪氨酸溶液的吸光值，以酪氨酸浓度为横坐标，以该浓度下溶液所对应吸光度为纵坐标作标准曲线，计算回归方程和R2值。

（5）水解度的确定。

水解度DH=游离氮/总氮

①测总氮量（凯氏定氮法）

参考GB5009.5进行总氮的测定，在进行样品测定的同时做试剂空白，计算总氮含量。

②甲醛滴定法测定游离氮

移取2mL抽滤的水解液，分别置于250mL的锥形瓶中，加水25mL；其中一份加3滴中性红指示剂，用标定的NaOH溶液滴定至琥珀色为终点。另一份加入中性甲醛10mL及3滴百里酚酞指示剂，摇匀，静置1min，（此时蓝色消失）。再用上述标定过的NaOH溶液滴定至淡蓝色。记录两次滴定所消耗的NaOH的毫升数，计算游离氮的含量。

（6）还原力的测定

配制一系列浓度为5%的红花籽粕底物溶液（取2.5g籽粕，加缓冲液50mL），分别加入中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，先调节pH，进行超声波处理10min，水解反应1h，反应结束以后经过100℃灭酶处理10min，在10000r/min转速下进行冷冻离心，时间为15min，上清液经过冷冻干燥后备用。选用上清液来测定酶解液的还原能力。

取上清液备用，将酶解液稀释1倍，取1.0mL红花籽粕酶解液于10mL的试管中，依次加入0.2mol/LpH6.6的磷酸盐缓冲液2.5mL、质量分数为1%的铁氰化钾溶液2.5mL并且充分混合均匀，于50℃条件下水浴保持20min，并迅速冷却，然后加入质量分数为10%三氯乙酸溶液2.5mL，并且充分混合均匀，在3000r/min转速冷冻离心10min。吸取离心后的上清液2.5mL，加入蒸馏水2.5mL和质量分数为0.1%三氯化铁溶液0.5mL，静置10min，在700nm波长下测定溶液吸光值，所有测定值均为三次数据平均值。以700nm波长处的吸光值大小来反映酶解液的还原力的大小，吸光值越大，表明酶解液的抗氧化性越强。

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