北美水貂源沙门氏菌的分离鉴定及耐药性检测（一）

沙门氏菌(Salmonella)病又称副伤寒，是一种在毛皮动物养殖过程常见的急性传染病，常发于6—8月，呈地方性流行，主要表现症状为发热，下痢腹泻，体重减轻，出现神经症状，流产等。英国、丹麦、加拿大等国均有北美水貂(Mustelavison)感染沙门氏菌患病的报道，国内，在我国河北、东北三省、山东等地区也有相关病例报道。目前，沙门氏菌的预防与治疗以抗生素药物为主。近年来对沙门氏菌的耐药性研究结果显示，人源、动物源沙门氏菌的多重耐药情况和耐药程度逐年递增，并通过饮水和食物等方式在人和动物之间不断传递。抗生素类药物滥用，给细菌造成选择压力是造成多重耐药情况日益严重的主要原因之一，因此，在养殖中合理应用治疗动物疾病尤为重要。

为调查秦皇岛地区北美水貂沙门氏菌的检出率及耐药情况，对65份水貂样品中的细菌进行分离纯化，采用细菌的鉴定培养、革兰氏染色、生化鉴定和16SrDNA鉴定分离菌，采用小鼠致病性试验研究分离菌株的致病性，采用KB纸片法检测分离菌的耐药性。结果显示，经鉴定共计分离出9株沙门氏菌，分离率13.85%(9/65)；9株沙门氏菌均可致小鼠发病死亡，死亡率20%—100%；9株沙门氏菌分别对5—11种抗生素药物耐药，氟苯尼考、替米考星、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和复方新诺明的耐药率高达100%，土霉素敏感率最高，为88.89%(8/9)。上述研究结果表明，秦皇岛地区从水貂分离到的沙门氏菌均具有一定的致病力和多重耐药性，为该地区水貂沙门氏菌病的防治提供参考。

本文对2019年秦皇岛地区送检北美水貂的沙门氏菌携带情况进行调查，并对分离菌株的致病性和耐药性进行研究，旨在为该地区北美水貂沙门氏菌病的防治提供数据支持。

1材料与方法

1.1样品

2019年3—9月收集秦皇岛地区病死北美水貂病料65份，30—180日龄不等。

1.2主要试剂

H.E.琼脂培养基购自青岛海博生物公司；革兰氏染色液购自京博奥拓达科技有限公司；ID32E肠杆菌科和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂条购自法国梅里埃公司；D2000plusDNAladder，购自中科瑞泰科技有限公司；2×TaqMasterMix，细菌DNA基因组提取试剂盒，胶回收试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；pMD19-T载体，购自宝日医(TaKaRa)生物技术有限公司；药敏纸片购自杭州天和微生物科技股份有限公司；序列测定服务由上海生工生物工程公司提供。昆明小鼠(体重20±5g)购自北京维通利华试验动物有限公司。

1.3引物

细菌16SrDNA鉴定通用引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列为27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R:TACGGYTACCTTGTTACGACTT。

1.4细菌的分离纯化

无菌采取病死水貂肝脏、脾脏、心脏，于超净台中接种于H.E.琼脂培养基，置于37℃恒温培养箱中培养18—24h，挑取黑绿色且中心有黑点的菌落重新于H.E.培养基中划线纯化培养18—24h，挑取符合上述特征的单菌落接种于LB培养基中，置于37℃恒温摇床培养18—24h。

1.5分离菌的革兰氏染色

挑取纯化后的单菌落进行革兰氏染色，染色操作按照试剂说明书进行，染色后在光学显微镜下观察细菌的染色特征和形态。

1.6分离菌的生化鉴定

生化鉴定试验参照ID32E肠杆菌科和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂条进行，用ATB自动生化鉴定系统对结果判定。

1.7分离菌的16SrDNA鉴定

按照细菌DNA基因组提取试剂盒说明书提取分离菌的DNA作为PCR模板。PCR体系为：上、下游引物和模板各1μL，ddH2O22μL，2×TaqMasterMix25μL，总体积为50μL。PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min。用胶回收试剂盒回收1500bp左右条带，回收产物连接pMD19-T载体并转入DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基培养，挑取阳性菌落置于含氨苄青霉素的LB培养基中增殖培养，送上海生工生物工程公司测序。测序结果在NCBI的BLAST分区检索并比对分析。

1.8分离菌的致病性试验

参考文献中的剂量与方法，每株分离菌分别感染5只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.2mL用高压灭菌后的PBS调整浓度后的菌液(浓度1×108cfu/mL)，设置对照组一组，每只小鼠注射0.2mL的无菌PBS，其余条件与分离菌感染组相同。观察并记录小鼠死亡发病情况。

1.9分离菌的药物敏感性试验

按照美国临床和试验室标准协会(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI)标准的操作和判准，采用KB纸片法检测分离菌对β-内酰胺类(氨苄西林、头孢曲松、阿莫西林)，氨基糖苷类(阿米卡星、新霉素、卡那霉素)，四环素类(多西环素、土霉素)，氟喹诺酮类(环丙沙星、恩诺沙星)，氯霉素类(氟苯尼考)，大环内酯类(替米考星)，磺胺类(磺胺间甲氧、磺胺二甲氧、复方新诺明)，共计15种抗生素的敏感性。

2结果

2.1细菌的分离纯化

从65份样品中共计分离出9株疑似沙门氏菌的菌株。疑似菌株在H.E.琼脂培养基培养菌落呈圆形，边缘整齐，微凸，蓝绿色，菌落中间有黑点(图1A)。

2.2分离菌的革兰氏染色

经革兰氏染色，9株分离菌均为革兰氏阴性短杆菌，两端钝圆(图1B)。

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