真菌毒素的检验（一）

已知的真菌毒素有数百种。主要产毒真菌为曲毒属、青霉属、镰刀菌属的真菌以及其他菌属的真菌。曲霉毒素中最重要的是黄曲霉毒素。在潮湿温暖的季节，粮食、油料及干果中很易生出黄曲霉毒素，如许多国家在玉米、花生及花生油、花生饼、花生酱、棉籽饼、山核桃、无花果、榛子、可可豆、杏仁、奶粉、牛奶、水牛奶、酸奶、奶酪、大米等都曾查出黄曲霉毒素。日本及中国还曾从发酵豆制品(如酱及酱油)中发现黄曲霉毒素。常见真菌毒素见表。

一、黄曲霉毒素的检验

黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉产生的一类结构类似的代谢混合产物，有17种之多，包括B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、P₁、Q、H₁、GM、B_2a和毒醇。其基本结构都是二呋喃环和香豆素，前者为基本毒性结构，后者为为致癌物。在紫外线下，黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂发蓝色荧光，黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂发绿色荧光。黄曲霉毒素M₁是黄曲霉毒素B₁在体内经过羟化而衍生成的代谢产物。黄曲霉毒素的相对分子质量为312～346。难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醇中。一般在中性及酸性溶液中较稳定，在pH 9～10的强碱溶液中分解迅速。黄曲霉毒素非常稳定，耐热，在熔点(200～300℃)之下不会分解(黄曲霉毒素B₁的分解温度为368°C，且其毒性非常强，主要损伤肝脏，使肝细胞坏死、出血及胆管增生，有明显的致癌作用。

黄曲霉毒素常存在于土壤、动植物、各种坚果(特别是花生和核桃)中，在大豆、稻谷、玉米、通心粉、调味品、牛奶、奶制品、食用油、咸鱼等制品中也经常发现黄曲霉毒素。

黄曲霉菌的检测方法包括：薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC） (液-液提取和固相提取)、微柱筛选法、酶送金疫吸附法皿ISA)、免疫亲和柱-荧光分光光度法、免疫亲和柱HPLC法等。TLC虽然分析成本较低，但操作步骤多，灵敏度差；HPLC虽然灵敏度高，但样品处理烦琐，操作复杂，仪器昂贵。ELISA法重复性差，试剂寿命短，需要低温保存。此外，这些方法都具有如下共同的不足之处：①在操作过程中，需要使用剧毒的黄曲霉毒素作为标定标准物，对操作人员造成巨大的危险；②在对样品进行预处理过程中，需要使用多种有毒、异味的有机溶剂，不仅毒害操作人员，而且污染环境；③操作过程烦琐，时间长，劳动强度大；④仪器设备复杂笨重，难以实现现场快速分析；⑤灵敏度较差，无法满足欧盟及其他一些国家和地区的标准要求。

(一)微柱筛选法

1、原理

试样提取液通过由氧化铝与硅镁吸附剂组成的微柱色谱管，杂质被氧化铝吸附，黄曲霉毒素被硅镁吸附剂吸附，在365nm紫外线下呈蓝紫色荧光，其荧光强度在一定范围内与黄曲霉毒素的含量成正比，由于微柱不能分离黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂，故结果为黄曲霉毒素的总量。

2、试剂

①石油醚：沸程60～900°C或30～600°C。

②中性氧化铝：色谱用100～200目。

③酸性氧化铝：色谱用100～200目。

④无水硫酸钠：过40～80目筛或80～100目筛。

⑤硅镁吸附剂：色谱用100～200目。

⑥甲醇水溶液：(55+45)。

⑦ 展开剂：丙酮一三氯甲烷(1+9)。

⑧脂棉：用索氏提取器以二氯甲烷为溶剂提取2h后，挥干后储于瓶中保存。

⑨曲霉毒素B₁标准液：用苯-乙腈(98+2)配成0.4μg/mL的储存液及0.1μg/mL的使用液，闭光冷藏。

注：色谱用氧化铝、硅镁吸附剂、无水硫酸钠应在120℃活化2h。

3、仪器

①紫外光灯：8～100W，带有波长365mm滤光片。

②内径0.4cm、长12cm的玻璃管，为加液方便上加一段粗管。

③微柱管架。

④微量注射器：50mL。

4、测定步骤

(1)提取

①粮食、花生及其制品：取粉碎过筛(20目)试样20.00g于具塞锥形瓶中，加100mL甲醇水溶液，30mL石油醚，密塞振摇30min，静置片刻，过滤于50mL具塞量筒中，收集50mL甲醇水溶液(注意切勿将石油醚层带入滤液中)，转入分液漏斗中，加50mL硫酸钠溶液 (20g／L)稀释，加三氯甲烷10mL，轻摇2～3min，静置分层，三氯甲烷层通过装有5g无水硫酸钠的小漏斗脱水(以少量脱脂棉球塞住漏斗径口，并以少量三氯甲烷润湿)，并滤入10mL比色管中，再向分液漏斗中加入3mL三氯甲烷重提一次，脱水后滤入原比色管内，以少量三氯甲烷洗漏斗并定容至10.0mL，密塞，混匀，待测。此样液1mL相当于1.0g试样。

②植物油：称混合油样10.00g于20mL的烧杯中，用50mL石油醚分数次洗入分液漏斗中，加50mL甲醇水溶液轻摇2～3min，静置分层，将下层甲醇水转入另一分液漏斗中，加50mL硫酸钠溶液(20g／L)稀释，加三氯甲烷10mL，以下按①中自“轻摇2～3min……”起依法操作。此样液1mL相当于1.0g试样。

③发酵酒、酱油、醋等水溶性试样：啤酒等含二氧化碳的试样，需在烧杯中于水浴上加热，搅拌，除去气泡，否则易乳化。称混匀试样20.00g于小烧杯中，以80mL硫酸钠溶液(20g/L)洗人分液漏斗中，加三氯甲烷10mL，此样液1mL相当于2.0g试样。

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