白菜型油菜srb多室性状的遗传分析与分子鉴定（二）

1.7RNA抽提和基因表达分析

抽提拟南芥生长20d的叶片RNA进行RT-PCR的基因表达量检测。RNA抽提、反转录和RT-PCR等程序详见Fan等的方法BrCLV3和内参基因18SrRNA的表达检测引物对分别为DXP109/DXP129和18SrRNAF/R，序列详见表1。

2 结果与分析

2.1 多室白菜型油菜srb的角果形态分析

对多室白菜型油菜srb的花器官和角果变异进行观察和分析发现,其花器官数目变异与多室黄籽沙逊ml4类似,即：花萼和花瓣等花器官数目正常；雄蕊数目基本正常，但在极少数花中可以观察到7个(图1-a～j)；雌蕊相对于WT明显增粗。srb的角果多室性状遗传稳定，单株多室角果比例94.7%～100.0%，平均为97.9%，每角果具有3～4个心皮(平均3.5个心皮)。多室角果平均长、宽和厚分别为37.0、6.4和3.8mm；较两室角果显得短而粗。

对子房进行石蜡切片观察，WT材料的子房为两室，是由2个心皮相对发育成一个完整的假隔膜，将心皮分割成2个腔室，假隔膜两侧分别着生1列种子；srb的三室子房则由3个心皮向中间发育形成“Y”字型假隔膜，将角果分割成3个腔室，假隔膜上着生3列种子，果皮分为3瓣(图1-x)；在srb和ml4的四心皮子房内，2个近乎平行排列的假隔膜将子房内腔分隔成3个腔室，中间的腔室比两侧的腔室大，中间的腔室着生2排胚珠，而两侧的腔室各着生1排胚珠，其假隔膜的横切面呈“Ⅱ”型(图1-y)。

2.2 白菜型油菜srb多室性状的遗传分析

为确定srb中多室性状的遗传规律，将其与两室白菜型油菜WT进行正反交，F₁单株全部表现为两室，表明srb中的多室性状由隐性核基因控制，且无细胞质效应(表2)。在F₂分离群体中，两室表型单株(78株)与多室表型单株(23株)符合3∶1的分离比(χ2=0.27，P＞0.05)。表明srb中的多室性状受1对隐性核基因控制。

为确定srb中的多室基因是否与我们前期克隆的多室基因Brclv3相同，进一步将srb与ml4进行等位测验发现，它们的正反交F1和F2分离群体的所有单株全部表现为多室(表2)。表明srb中的多室基因与ml4中的多室基因等位,因此它们的多室性状可能均由BrCLV3基因的突变所导致。

2.3 白菜型油菜srb中多室候选基因BrCLV3的克隆与序列分析

我们对srb中的BrCLV3等位基因的编码区、2.3kb的启动子区和2.5kb的3'端侧翼序列进行比较测序。与WT中的BrCLV3序列比对分析，共发现3处碱基序列变异(图2-a)。其中，位于3'端的SNP差异和第2个内含子中ATAT插入/缺失差异都不会引起该基因蛋白序列的改变,而位于第3个外显子中的C/G单核苷酸突变可导致编码蛋白的1个氨基酸替换。进一步比较ml4、srb和Chiifu-401(已发表基因组序列的白菜，两室表型)之间的氨基酸序列差异发现,该突变氨基酸位于CLEmotif的第12位，由组氨酸突变成天冬氨酸，将其命名为Brclv3_Asp12；它与前期在ml4中发现的CLEmotif上的碱基变异不同，因此Brclv3_Asp12是一个新的等位突变,可引起CLV3多肽信号的序列突变(图2-b)。在拟南芥中,CLEmotif是CLV3多肽信号分子的重要功能域,由12个保守的氨基酸组成,其中第12位组氨酸对于维持茎顶端分生组织的大小至关重要。因此，本研究新发现的第12位His-to-Asp氨基酸替换可能影响BrCLV3基因的正常功能发挥，从而影响角果的正常发育。

2.4 Brclv3Asp12等位基因特异的SNP标记在分离群体中的表型共分离验证

针对Brclv3_Asp12中的C/G单核苷酸变异开发了特异性的SNP标记，并对srb×WT杂交产生的F2分离群体进行了BrCLV3基因型的鉴定。结果表明，BrCLV3纯合基因型(AA)单株都为两室角果表型,Brclv3_Asp12纯合基因型单株(aa)都为多室角果表型，杂合基因型单株(Aa)表现为两室或近乎两室角果表型(图3)；3种基因型单株的比例(AA∶Aa∶aa)符合1∶2∶1的分离比(χ2=0.80，P＞0.05)。该结果证实Brclv3_Asp12中的C/G变异与多室表型共分离，表明该SNP变异可能是引起srb中多室角果产生的原因。

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