单核细胞增生李斯特菌质粒DNA参考物质的研制（三）

2.2 pDNA Listeria的均匀性

为了满足核酸参考品的使用要求，依照方差分析法(F-检验法)评价了pDNA的瓶内和瓶间均匀性，并对数据进行了统计学分析。制备的质粒DNA标准物质pDNA Listeria的瓶内均匀性和瓶间均匀性统计数据见表2。结果显示，pDNA的性质值在瓶内和瓶间均质性上差异无统计学意义(P>0.05),表明该pDNA满足qPCR的参考材料的均匀性要求。根据公式计算得出的均匀度不确定度为0.67μg/mL。

2.3 pDNA Listeria的稳定性

在4、-20、-70、56℃的温度下进行了180天的短期稳定性评估，并在56℃进行了60天的极端温度测验，结果表明pDNA Listeria降解不明显(见表3)。采用线性模型作为pDNA的经验模型进行长期稳定性评价，通过12个月采样结果建立单项线性回归方程Y=β1+β0(β1为-0.017 58,β0为29.51),自由度为n-2和P=0.95(95%置信水平)的学生分布t-因子等于1.812,结果提示|β1|

2.4 pDNA Listeria定值

8个不同实验室共同测定pDNA的属性值，测量数据遵循正态分布，并且每个单元的测量数据的平均值的精度相等。8个实验室定值的平均值29.85μg/mL被认为是pDNA Listeria的属性值。pDNA定值过程带来的的不确定度uq由统计公式(4)计算得出，定值引入的不确定度为0.22μg/mL。

2.5 pDNA Listeria综合不确定性分析

质粒DNA参考材料的不确定度包括由不均匀性引入的不确定度(uh)、长期保存稳定性引入的不确定度(us)、定值过程中引入的不确定度(uq),综合三种不确定度按照公式(5)计算参考物质的标准不确定度，按公式(6)计算扩展相对不确定度，结果表明标准不确定度1.57μg/mL。扩展不确定度为3.14μg/mL。

2.6 qPCR标准曲线的建立

通过梯度稀释pDNA Listeria作为模板(106、105、104、103、102和101copy/mL)进行qPCR分析。每个反应重复3次，并根据循环阈值(Ct值)与模板浓度之间的关系建立标准曲线(见图3)。各标准曲线的线性相关系数如表4所示。在本研究中，所有靶基因的扩增效率在94.3%～98.1%的范围内，且线性良好，表明合成基因片段可作为qPCR标准品，且qPCR核酸检测参考品可用于单增李斯特菌的检测。使用低至101copy/mL的模板浓度(每次9次重复反应),可以在7次中检测到全部3个基因。结果表明，所有qPCR检测的LOD值(检测下限)约为101copy/mL(见表4)。

2.7 pDNA Listeria和基因组DNA标准品的替代

使用了基因组标准品和质粒DNA参考材料梯度稀释为模板绘制标准曲线，每条标准曲线重复6次。统计分析每个标准曲线的扩增效率和斜率(t检验)。结果证明，通过评估斜率和扩增效率，在95%置信度下，基因组DNA建立的标准曲线与pDNA Listeria建立的标准曲线之间差异无统计学意义(P>0.05),见表5。因此，可以使用pDNA Listeria代替基因组DNA来检测单增李斯特菌。

3讨论

传统的基因检测标准物质通常为病原体基因组核酸提取物，但是由于需要检测的靶标序列在基因组中不能以均匀和量值可溯源的形式存在，因此在进行质量评价的时候，靶标序列和量值都难以溯源，各个实验室的检测结果难以进行比较。因此亟需研制新型核酸参考材料。

人工DNA合成技术为参考标准物质的制备提出了新的可能，可以通过人工合成获得完整的基因片段，甚至通过基因工程技术将多个目的基因串联在同一个质粒载体上，进而实现同时对多个检测目的基因的检测进行质量参考。

本研究中，根据李斯特菌检测的需要，构建了pDNA Listeria作为单增李斯特菌定性检测和检测性能评价的参考品。一个质粒同时覆盖hlyA、plcB、inlA 3种检测目标。检测序列根据NCBI公布的hlyA、plcB、inlA序列人工合成，质粒的浓度由不同的实验室联合定值确认，因此在序列的准确性和量值的可溯源性上，均可提供稳定的保障。同时通过对pDNA Listeria进行均匀度和稳定性分析，显示pDNA Listeria纯度良好，均匀性、稳定性满足ISO指南35的相关要求。同时通过qPCR分析了pDNA Listeria在单增李斯特菌qPCR检测中的应用，结果显示，使用pDNA Listeria制备的标准曲线，线性良好，可替代单增李斯特菌基因组DNA用于hlyA、plcB、inlA 3基因的PCR检测的质量参考。

因此，本研究研制的单增李斯特菌质粒DNA参考物质为单增李斯特菌hlyA、plcB、inlA基因PCR相关检测提供了量值溯源的依据，为单增李斯特菌检测实验室质量控制提供了有力保障。质粒DNA标准物质具有短期内可大量复制、经济高效、量值准确可靠等特点，目前在单增李斯特菌检测中，已见单独使用hlyA基因制备质粒标准品的报道。在沙门菌检测中，也有使用包含invA基因质粒作为PCR检测参考品的报道。但是将多种可用于鉴定和毒力分析的靶标合成到一个质粒中，实现一种参考品对多种检测靶标进行质量参考的实践尚未见报道。通过此项研究，希望该标准物质在我国单增李斯特菌检验实验室能够较好推广应用，能够较好地提高单增李斯特菌检验实验室相关项目的检测水平，保障各实验室测量结果的可比性、准确性，为检验结果的互认和共享打下了良好的基础，为预防由单增李斯特菌引发的大规模突发性公共安全事件进行技术储备。

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