农药残留的酶活性抑制与免疫分析技术的免疫分析法（四）

②反应介质中的电解质：电解质是抗原抗体反应系统中不可缺少的成分，它可使免疫复合物出现可见的沉淀或凝集现象。一般用8.5g／LNaCl溶液作为抗原和抗体的稀释剂与反应介质，特殊需要时也可选用较为复杂的缓冲液。如果反应系统中电解质浓度低甚至无，抗原抗体不易出现可见反应，尤其不易形成沉淀反应。如果电解质浓度过高，则会出现非特异性蛋白质沉淀。

③反应温度：温度对免疫反应的影响显而易见，温度过高会使生物分子变性，温度过低则使生物分子的活性降低或丧失。除了上述较极端的情况以外．抗原抗体的温度适应能力比较强，一般在15～40℃的范围内均可以正常进行。在这个范围内，温度的变化主要影响反应速度，较少影响反应结果。抗原抗体反应的最适温度为37℃。

④应时间：时问本身不会对抗原抗体反应主动施加影响，但实验过程中观察结果的时间不同可能会看到不同的结果。时间因素主要由反应速度来体现，反应速度取决于抗原抗体亲和力、反应类型、反应介质、反应温度、反应模式等因素。一般免疫分析固液两相免疫反应达到平衡的时间为1～3h。在优化条件或反应促进剂作用下，可缩短免疫反应达到平衡的时间。均相免疫反应比非均相免疫反应达到平衡的速度快得多，一般37℃下反应15rain即可达平衡。

二、免疫分析方法类型

免疫分析方法有多种不同的分类方式，按抗原抗体反应是在固液两相问还是在单一液相中进行和是否需要进行固液分离，分为非均相免疫分析和均相免疫分析；按抗原抗体结合反应的方式不同，免疫分析可分为非竞争型免疫分析和竞争型免疫分析；按抗原(或抗体)是否进行标记可分为标记免疫分析和非标记免疫分析。

(一)非均相免疫分析

非均相免疫分析通常在固液两相中进行。以适当的标记物标记抗体或抗原，将抗原或抗体固定于适当的固相载体(如聚苯乙烯微孔板)表面，抗原抗体反应体系中同时存在液相中游离的标记物和固相上结合的标记物，两相的标记物都具有活性。在反应平衡后将固相和液相分离，测定固相上结合状态的标记物的活性或液相中游离标记物的活性，推算待测物的含量。酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)是目前最常用的非均相免疫测定法。这种测定方法有3种必要的试剂：①包被固相用抗原或抗体，即免疫吸附剂(immunosorbent)；②酶标记的抗原或抗体，称为酶结合物(conjugate)。

③酶的底物和显色剂。酶联免疫吸附测定法既可用于测定抗原，也可用于测定抗体。由于抗原抗体反应在两相间进行，反应到达平衡所需时间长，反应平衡后需要进行两相分离，故检测速度慢。

(二)均相免疫分析

均相免疫分析是在均匀体系(通常在液相)中进行的。如可以用适当的标记物(如酶、荧光剂等)标记抗体或抗原，利用抗原抗体反应形成复合物后标记物的活性(如酶活性)受到抑制或其他信号的变化(如荧光偏振、荧光增强、荧光猝灭等)来检测抗体或抗原，反应后不需要分离结合的标记物和游离的标记物，直接测定系统中的标记物的活性或相关信号的变化，来确定结合的或游离的标记物的数量，从而得到待测抗原或抗体含量的信息。均相免疫分析不仅可以用于蛋白质等大分子抗原或抗体的测定，也可用于农药、药物、激素、毒品、兴奋剂等小分子化合物的测定。均相免疫反应达到平衡的速度快，不需要进行两相分离，方法简便快速。

(三)非竞争型免疫分析

非竞争型免疫分析主要有双抗体夹心法、间接法和捕获包被法。

1、双抗体夹心法检测抗原病毒等颗粒抗原、蛋白质等大分子一般具有多个抗原决定簇，对这类抗原的检测多采用抗不同抗原决定簇的双抗体夹心法。

①将特异性抗体包被于固相载体。洗涤除去游离的抗体及杂质，封闭固相上未结合抗体的位点。

②待检抗原，37℃保温反应，样品中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体合物，洗涤除去未结合的游离物质。

③加抗另一抗原决定簇的酶标记抗体，37℃保温反应。固相上的抗原抗体复合物与酶标抗体结合，形成抗体一抗原一酶标抗体三元复合物。彻底洗涤去除未结合的酶标抗体。此时固相上结合的酶标抗体量与样品中被测抗原量在一定范围内呈正相关。

④加酶的底物和显色剂，固相三元复合物上的酶催化显色剂产生有色产物，样品中抗原的量与酶促显色强度呈正比，通过比色测定可对抗原进行定性分析和定量分析。

在实际应用中，如抗体的来源为抗血清，包被和酶标记用的抗体最好分别来自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相和制备酶标抗体。这样的双抗体夹心法具有很强的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，进行一步法检测。

2、间接法检测抗体间接法检测抗体的原理。用抗原包被固相，加入待检样品和酶标二抗，待测抗体与固相抗原结合，酶标二抗与待测抗体结合，通过检测酶标二抗的酶促显色反应来检测待测抗体。

①将特异性抗原包被于固相。洗涤除去未结合的抗原及杂质。

②加待测样品，37℃保温反应。样品中的待测抗体与固相抗原结合，形成抗原抗体复合物。洗涤去除样品中游离的其他成分。

③酶标二抗，固相抗原上结合的待测抗体与酶标二抗结合。洗涤去除游离物。

④加酶的底物和显色剂显色，固相上结合的酶标二抗量(酶促显色反应强度)与样品中待测抗体量在一定范围内呈正相关。

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