2种抗氧化剂对α-葡萄糖苷酶的抑制作用（一）

植酸是一种重要的有机磷天然抗氧化剂，广泛存在于谷类和植物种子中。植酸作为抗氧化剂的应用型研究报道越来越多。Munoz等研究报道天然的磷化合物植酸，可作为尿石症的潜在抑制剂。Lv等研究发现植酸在帕金森病治疗中起到一定的作用，显著抑制MPTP诱导的黑质（SN）多巴胺能细胞损失，抑制小胶质细胞激活和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）。Thompson等研究证实了添加内源植酸对减缓淀粉消化率和对豆科植物的血糖反应能力有影响。抗坏血酸棕榈酸酯是一种通过化合物合成的被国家标准限定的抗氧化剂，已被药品管理局（FDA）提议作为美国安全食品和天然二级食品抗氧化剂。抗坏血酸棕榈酸酯具有抗氧化活性，在食品工业中应用广泛，其表现出生物活性，可用于治疗肿瘤等多种疾病。Fathi等利用表面等离子共振技术研究牛血清白蛋白与抗坏血酸棕榈酸酯之间的相互作用，发现它们之间的结合会影响蛋白的构象，从而可能干扰生物活性分子在体内的运输和分布。Zhou等研究发现抗坏血酸棕榈酸酯可用于协同抗肿瘤治疗。

糖尿病是一种伴随代谢和内分泌紊乱的重大疾病。大多数糖尿病患者受到胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷的2型糖尿病（T2DM）的影响，并出现各种并发症，包括大血管和微血管功能障碍等。通常治疗T2DM的策略是饮食控制，适度运动，使用降血糖和降脂剂等。抑制α-葡萄糖苷酶是治疗糖尿病的手段之一，有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性可减缓餐后血糖水平的提高。Kunyanga等研究表明植酸含量高的植物可有效抑制食品样品中α-葡萄糖苷酶的活性，其抑制程度与植酸含量直接相关，而植酸含量可能对餐后血糖水平的潜在治疗有协同作用。然而，植酸和L抗坏血酸棕榈酸酯2种抗氧化剂对α-葡萄糖苷酶的抑制机理未见报道。本研究通过酶动力学与分子对接技术研究植酸和L-抗坏血酸棕榈酸酯对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，为这2种抗氧化剂功能性研究提供新思路，同时为开发新型酶抑制剂用于治疗糖尿病提供理论基础。

1 材料与设备

酿酒酵母的α-葡糖苷酶（EC3.2.1.20），美国Singma-Aidrich公司；阿卡波糖，上海麦克莱恩生化科技有限公司；对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）、对硝基苯（pNP），北京百灵威科技有限公司；无水碳酸钠（Na₂CO₃），国药集团化学试剂有限公司；植酸、L-抗坏血酸棕榈酸酯，上海陆广生物科技有限公司；试验用水为超纯水。
SynergyH1全功能酶标记仪器，美国BioTek仪器有限公司；HWS-24电热恒温水浴，上海恒世仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 植酸和L-抗坏血酸棕榈酸酯对α-葡糖苷酶的抑制效果

α-葡萄糖苷酶能使pNPG水解生成pNP，生成物在紫外吸收波长405nm处具有最大吸收值。化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果测定方法根据参考文献进一步修改。α-葡萄糖苷酶的测活总体系为340μL，首先加入133μL0.1mol/L磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钠和磷酸氢二钠混合配制而成，pH6.8），加入10μL5U/mLα-葡萄糖苷酶稀释液，随后加入7μL不同浓度梯度的效应物溶液，混合均匀后在37℃下孵育10min。加入20μL5mmol/L底物pNPG溶液，混合均匀后在37℃下孵育20min。170μL0.1mol/LNa2CO3终止反应。取200μL混合液于96孔板中，采用SynergyH1全功能酶标记仪器在405nm波长处测得吸收值。

待测效应物为植酸和L-抗坏血酸棕榈酸酯，植酸浓度依次为0.15，0.16，0.17，0.18，0.19，0.20，0.205，0.21，0.215，0.220，0.230mol/L，L-抗坏血酸棕榈酸酯浓度依次为0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.45，0.5，0.55，0.6mmol/L，每个梯度下平行测定5次，得到不同效应物浓度下最后反应体系的吸收值。以α-葡萄糖苷酶剩余酶活的抑制率降低至50%时效应物的浓度为即为ＩC50值。将没有效应物的反应作为空白对照组。

2.2 植酸和L-抗坏血酸棕榈酸酯对α-葡糖苷酶的抑制机理

的抑制机理待测效应物为植酸和L-抗坏血酸棕榈酸酯，效应物对α-葡萄糖苷酶抑制机理的研究是基于抑制效果的测定方法。α-葡萄糖苷酶的浓度梯度为5，4，3，2，1U/mL，底物pNPG浓度为5mmol/L，测定效应物在不同浓度下反应体系的紫外吸收波长。以酶的浓度梯度为横坐标，体系的反应速度为纵坐标绘制机理图，通过图中曲线是否过原点来判定效应物对α-葡萄糖苷酶的抑制机理。

2.3 植酸和L-抗坏血酸棕榈酸酯对α-葡糖苷酶的抑制类型

待测效应物为植酸和L-抗坏血酸棕榈酸酯，效应物对α-葡萄糖苷酶抑制类型的研究是基于抑制效果的测定方法。α-葡萄糖苷酶的浓度为5U/mL，底物pNPG的浓度梯度为5，3.9，2.8，1.7，1.1mmol/L，测定效应物在不同浓度下反应体系的紫外吸收波长。以pNPG浓度梯度的倒数为横坐标，体系的反应速度的倒数为纵坐标绘制Lineweaver-Burk类型图，图中曲线的交点位置判定效应物对α-葡萄糖苷酶的抑制类型。通过二次作Dixon图，计算抑制常数。

2.4 分子对接技术

分子对接技术可以进一步探索效应物与α葡萄糖苷酶的结合模式。PubChem中下载植酸和L-抗坏血酸棕榈棕榈酸酯的2D结构保存为SDF格式。通过Chem3DPro软件进行转化为3D结构保存为mol2格式。UniProt蛋白质资源数据检索酿酒酵母α-葡糖苷酶的一级序列，访问代码为P53341。选择与靶标具有72.4%序列同一性的酿酒酵母异麦芽糖酶（PDB编码3AＪ7，1.38Å分辨率）的晶体结构作为建模模板。使用MolecularOperatingEnvironment（MOE）同源构建模型工具构建酿酒酵母α-葡糖苷酶的3D结构。将酶蛋白和效应物能量最小化至0.05RMS梯度便于两者对接。构建的配体化合物和酶蛋白导入MOE软件中同一窗口，通过Simulationdock将酶和配体进行半柔性对接。对于每个配体，配体分子通过姿势的扭转形成多种构象，尽可能稳定的构象与酶活性口袋结合。筛选出最好配体构象与酶蛋白活性位点氨基酸残基的结合模式和相互作用，并使用可视化工具PyMol程序显示两者结合的三维图像。

2.5 数据处理

使用SPSSStatistics17.0软件进行数据统计，使用OriginPro8.5软件绘制图形与分析。使用Chem3DPro软件转化3D结构，使用MolecularOperatingEnvironment（MOE）软件进行分子对接，使用PyMol软件观察对接结果的结合模式。所有数据值均表示为“平均值±标准误差”。

3 结果与分析

3.1 效应物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

植酸和L-抗坏血酸棕榈酸酯对α-葡萄糖苷酶均有抑制效果。效应物对酶的相对剩余酶活的抑制率随着效应物浓度的增加而降低，当植酸浓度达到0.195mol/L时，抑制率降低为71%，当抑制率降低到50%时，植酸的浓度（ＩC50）为（0.207±3.137）mol/L。L-抗坏血酸棕榈酸酯对α-葡萄糖苷酶抑制酶活达到50%时，浓度为（0.39±0.00838）mmol/L。就ＩC50而言，L-抗坏血酸棕榈酸酯对α葡萄糖苷酶的抑制效果优于植酸。可能是由于L抗坏血酸棕榈酸酯头部带有酚羟基的苯基更容易与α-葡萄糖苷酶结合。阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶半数抑制率ＩC50为658mmol/L，植酸的抑制效果没有阿卡波糖的效果好，然而L-抗坏血酸棕榈酸酯的抑制效果是阿卡波糖的上千倍。

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