维生素的测定（一）

发布时间：2020-12-18 16:30 编辑者：伟业计量

一、概述维生素是维持人体正常生理功能所必需的一类有机营养素。食品中维生素的含量都很低，因此，对维生素的分析需采用精密度高的分析方法。主要方法有比色法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法、荧光法等。另外，化学分析法中的滴定法，具有简便、快速、不需特殊仪器等优点，为广大基层实验室所普遍采用。

二、脂溶性维生素的测定

(一)维生素A和维生素E的测定--高效液相色谱法

1、原理试样中的维生素A及维生素E经皂化处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱反相柱(RP-C18)，将维生素A和维生素E分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。

2、仪器

①高效液相色谱仪(带紫外检测器)。②旋转蒸发器。③速离心机。④离心管：具塑料盖，1.5~30mL塑料离心管(与高速离心机配套)。⑤高纯氮气。⑥恒温水浴锅。⑦外检测器。

3、试剂

①无水乙醚：不含有过氧化物。

a.过氧化物的检查方法用2mL乙醚，加1mL10％碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴0.5％淀粉溶液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。

b．去除过氧化物的方法重蒸馏乙醚时，瓶中放入纯铁丝或铁末少许，弃去10％初液和10％残馏液。

②无水乙醇：不得含有醛类物质。

a.检查方法取2mL银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。

b．脱醛方法取2g硝酸银溶于少量水中，取4g氢氧化钠溶于温乙醇中，将两者倾入1L乙醇中，振摇后，放置暗处2d(不时摇动，促进反应)，经过滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸出的50mL。当乙醇中含醛较多时，硝酸银用量适当增加。

③无水硫酸钠。

④甲醇：重蒸后使用。

⑤重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏。

⑥抗坏血酸溶液(100g/L)：临用前配制。

⑦氢氧化钾溶液(1+1)。

⑧氧化钠溶液(100g/L)。

⑨酸银溶液(50g/L)。

⑩氨溶液：加氨水至硝酸银溶液(50g/L)中，直至生成的沉淀重新溶解为止，再加氢氧化钠溶液(100g/L)数滴，如发生沉淀，再加氨水直至溶解。

⑪维生素A标准溶液：视黄醇(纯度85%)或视黄醇乙酸酯(纯度95％)经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为lmL相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。

⑫生素E标准溶液：a-生育酚(纯度95％)、γ-生育酚(纯度95％)、δ-生育酚(纯度95％)。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg三种生育酚。临用前用紫外分光光度计分别标定此三种生育酚溶液的准确浓度。

⑬内标溶液：称取苯并[e]芘(纯度98％)，用脱醛乙醇配制成每1mL相当10μg苯并[e]芘的内标溶液。

4、操作方法

(1)试样处理

①皂化：准确称取1~10g试样(含维生素A约3μg，维生素E各异构体约为40μg)于皂化瓶中，加30mL无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加入5mL10％抗坏血酸、苯并[P]芘标准液2.00mL，混匀，加10mL氢氧化钾溶液(1+1)，混匀。于沸水浴回流30min，使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。

②提取：将皂化后的试样移入分液漏斗中，用50mL水分2~3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中，用约100mL乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有残渣，可将此液通过有脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗中。轻轻摇动分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。

③洗涤：用约50mL水洗分液漏斗中的乙醚层，用pH试纸检验直至水层不显碱性(最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加)。

④浓缩：将乙醚提取液经过无水硫酸钠(约5g)滤入与旋转蒸发器配套的250~300mL球形蒸发瓶内，用约100mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于55℃水浴中减压并回收乙醚，待瓶中剩下2mL乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚，立即加入2.00mL乙醇，充分混合，溶解提取物。将乙醇液移入一小塑料离心管中离心5min(5000r/min)。上清液供色谱分析。如果试样中维生素含量过少，可用氮气将乙醇液吹于后，再用乙醇重新定容，并记下体积比。

(2)标准曲线的绘制

①维生素A和维生素E标准浓度的标定：取维生素A和各维生素E标准液若干微升，分别稀释至3.00mL乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用吸光系数计算出该维生素的浓度。测定条件如表1所示。