维生素的测定（二）

②标准曲线的绘制：采用内标法定量。把一定量的维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚及内标苯并[e]芘溶液混合均匀。选择合适灵敏度，使上述物质的各峰高约为满量程70％，为高浓度点。高浓度的1/2为低浓度点(其内标苯并[P]芘的浓度值不变)，用此种浓度的混合标准进行色谱分析，结果见色谱图。维生素标准曲线绘制是以维生素峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，维生素浓度为横坐标绘制，或计算回归方程。如有微处理机装置，则按仪器说明用两点内标法进行定量。

不能将δ-生育酚和γ-生育酚分开，所以γ-生育酚峰中包含有β-生育酚峰。

(3)高效液相色谱分析：色谱条件(参考条件)如下。

①预柱：ultrasphere ODS 10μm，4mm×4.5cm。

②分析柱：ultrasphere ODS 5μm，4.6mm×25cm。

③流动相：甲醇+水=98+2，混匀，临用前脱气。

④紫外检测器波长：300nm，量程0.02。

⑤进样量：20μL。

⑥流速：1.7mL/min。

(4)试样分析取试样浓缩液20μL，待绘制出色谱图及色谱参数后，再进行定性和定量。

①定性：用标准物色谱峰的保留时间定性。

②定量：根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，以此值在标准曲线上查到其含量，或用回归方程求出其含量。

5、计算

式中：X——维生素的含量，mg/100g；

c——由标准曲线上查到某种维生素含量，μg/mL；

V——试样浓缩定容体积，mL；

m——试样质量，g。

计算结果表示到三位有效数字。

6、说明及注意事项

本方法为GB/T 5009.82—2003标准第一法。

本方法检出限分别为：维生素A：0.8ng；α-生育酚：91.8ng；γ-生育酚：36.6ng；δ-生育酚20.6ng。

(二)维生素D的测定——三氯化锑比色法：(AOAC法)

1、原理

维生素D在三氯甲烷溶液中，与三氯化锑结合生成一种橙黄色化合物，颜色的深浅与维生素D的浓度成正比，在500nm波长下测定其吸光值。

2、仪器

①可见/紫外分光光度计。

②分离柱。

3、试剂

①三氯化锑(250g/L)-三氯甲烷溶液：将25g干燥的三氯化锑迅速投入装有100mL三氯甲烷的棕色试剂瓶中，振摇，使之溶解，再加入无水硫酸钠10g。用时吸取上层清液。

②三氯化锑-三氯甲烷-乙酰氯溶液：在上述试剂①中加入为其体积3％的乙酰氯，摇匀。

③无水乙醚：不含过氧化物，检查方法与处理方法同维生素A和维生素E测定。

④无水乙醇：不含醛类物质，检查方法与处理方法同维生素A和维生素E测定。

⑤石油醚(沸程30～60℃)：重蒸。

⑥维生素D标准溶液：称取0.25g维生素D，用三氯甲烷稀释至100mL，此液浓度为2.5mg/mL。临用时以三氯甲烷配制成0.025～2.5μg/mL的标准使用液。

⑦乙二醇(PEG)600。

⑧白色硅藻土：Celite545(柱色谱载体)。

⑨氨水。

⑩无水硫酸钠。

⑪氢氧化钾溶液(0.5mol/L)。

⑫中性氧化铝：色谱用，100～200目。在550℃灰化炉中活化5.5h，降温至300ºC左右，取出装瓶。冷却后，每100g氧化铝加入4mL水，用力振摇，使无块状，瓶口封紧储存于干燥器内，16h后使用。

4、操作方法

(1)试样处理：皂化与提取同维生素A和维生素E的方法，如果试样中有维生素A共存，可用以下方法进行分离纯化。

①分离柱的制备：取一支内径为2.2cm，具有活塞和砂芯板的玻璃色谱柱。第一层：加入1～2g无水硫酸钠，铺平整。第二层：称取15g Celite545置于250mL碘价瓶中，加入80mL石油醚，振摇2min，再加入10mL聚乙二醇(PEG)600，剧烈振摇10min，使其黏合均匀，然后倾入色谱柱内。第三层：加5g中性氧化铝。第四层：加入2～4g无水硫酸钠。轻轻转动色谱柱，使第二层的高度保持在12cm左右。

②纯化：先用30～50mL石油醚淋洗分离柱，然后将试样提取液倒入柱内，再用石油醚继续淋洗。弃去最初收集的lOmL滤液，再用200mL容量瓶收集淋洗液至刻度。淋洗速度保持2～3mL/min。将淋洗液移入500mL分液漏斗中，每次加100～150mL水，洗涤3次(去除残留的聚乙二醇600，以免与三氯化锑作用形成浑浊物，影响比色)，将上述石油醚层通过无水硫酸钠脱水后，置于浓缩器中减压浓缩至干或在水浴上用水泵减压抽干，立即加入5mL三氯甲烷溶解备用。

(2)测定

①标准曲线的绘制：准确吸取维生素D标准使用液(浓度视试样中维生素D含量高低而定)0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL于10mL容量瓶内，用三氯甲烷定容。取上述标准比色液各lmL于1cm比色皿中，立即加入三氯化锑-三氯甲烷-乙酰氯溶液3mL，在500nm波长下，于2min内测定吸光度。绘制标准曲线。

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