维生素的测定（三）

②试样测定：吸取试样纯化液lmL于比色皿中，以下操作同标准曲线的绘制。

5、计算

式中：x——试样中维生素D的含量，mg/100g；

p——标准曲线上查得试样溶液中维生素D含量，μg/mL，如按国际单位，每国际单位=0.025μg维生素D；

V——试样提取后用三氯甲烷定容的体积，mL；

m——试样质量，g。

6、说明及注意事项

①本方法是A0AC选定的正式方法。本方法不能区分维生素D₂和维生素D₃，测定值是两者的总量。

②食品中维生素D的含量一般很低，而维生素A、维生素E、胆固醇、甾醇等成分的含量往往都大大超过维生素D，严重干扰维生素D的测定，因此，测定前必须经柱色谱除去这些干扰成分。

③操作时加入乙酰氯可以消除温度的影响，可使灵敏度比仅用三氯化锑提高约3倍，并可减少部分甾醇的干扰。

三、水溶性维生素的测定——维生素C的测定(2，4-二硝基苯肼比色法)

1、原理

总维生素C包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸。用酸处理过的活性炭把还原型维生素C氧化为脱氢维生素C，再继续氧化为二酮古乐糖酸，二酮古乐糖酸再与2，4-二硝基苯肼作用生成红色脎，根据脎在硫酸溶液中的含量与维生素C含量成正比，进行比色定量。

2、仪器

①恒温箱：37°C±0.5°C。

②可见-紫外分光光度计。

③捣碎机。

3、试剂

①硫酸(4.5mol/L) 小心地加250mL浓硫酸(相对密度1.84)于700mL水中，冷却后用水稀释至1000mL。

②85％硫酸：小心地加900mL浓硫酸(相对密度1.84)于100mL水中。

③2，4-二硝基苯肼溶液(20g/L)：溶解2g 2，4-二硝基苯肼于100mL硫酸(4.5mol/L)中，过滤。不用时保存于冰箱中，每次用前必须过滤。

④草酸溶液(20g/L)：溶解20g草酸(H₂C₂O₄)于700mL水中，稀释至1000mL；

⑤草酸溶液(10g/L)：取500mL草酸溶液(20g/L)稀释至1000mL。

⑥硫脲溶液(10g/L)：溶解5g硫脲于，500mL草酸溶液(10g/L)中。

⑦硫脲溶液(20g/L)：溶解10g硫脲于500mL草酸溶液(10g/L)中。

⑧盐酸(1mol/L)：取100mL盐酸，加入水中，并稀释至1200mL。

⑨维生素C标准溶液：称取100mg纯维生素C溶解于100mL草酸溶液(20g/L)中，此溶液每毫升相当于1mg维生素C。

⑩活性炭：将100g活性炭加到750mL盐酸(1m0l/L)中，回流1～2h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子(Fe³⁺)为止，然后置于110℃烘箱中烘干。

检验铁离子的方法：利用普鲁土蓝反应，将亚铁氰化钾(20g/L)与1％盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。

4、操作方法

(1)试样的制备

①鲜样的制备：称取100g鲜样及吸取l00mL20g/L，草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆，取10～40g匀浆(含1～2mg维生素C)倒入100mL容量瓶中，用草酸溶液(10g/L)稀释至刻度，混匀。

②干样制备：称1～4g干样(含1～2mg维生素C)放入乳钵内，加入草酸溶液(10g/L)磨成匀浆，倒入100mIL容量瓶中用草酸溶液(10g/L)稀释至刻度，混匀。

将上述试样过滤，滤液备用。不易过滤的试样可用离心机离心后，倾出上清液，过滤，备用。

(2)氧化处理：取25mL上述滤液，加入2g活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10mL此氧化提取液，加入10mL硫脲溶液(20g/L)，混匀，此试样为稀释液。

(3)显色反应

①于三个试管中各加入4mL氧化处理的稀释液，一个试管作为空白，在其余试管中加入1.0mL 2，4-二硝基苯肼溶液(20g/L)将所有试管放入(37±0.5)℃恒温箱或水浴中保温3h。

②3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷却至室温，然后加入1.0mL 2，4-二硝基苯肼溶液(20g/L)，在室温中放置10～15min后放入冰水内。其余步骤同试样。

(4)85％硫酸处理：当试管放入冰水后，向每一试管中加入5mL 85％硫酸，滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温下放置30min后比色。

(5)比色:用1cm比色皿，以空白液调零点，于500nm波长测吸光值。

(6)标准曲线的绘制

①加2g活性炭于50mL标准溶液中，振摇1min，过滤。

②取10mL滤液放入500mL容量瓶中，加5.0g硫脲，用草酸溶液(10g/L)稀释至刻度，维生素C浓度20μg/mL。

③取5mL、10mL、20mL、25mL、40mL、50mL、60mL稀释液，分别放入7个100mL容量瓶中，用硫脲溶液(10g/L)稀释至刻度，使最后稀释液中维生素C的浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL。

④按试样测定步骤形成脎，并比色。

⑤吸光值为纵坐标，维生素C浓度(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线或求得回归方程。

5、计算

式中：X——试样中总维生素C的含量，mg/100g；

c——由标准曲线查得或由回归方程算得的试样氧化液中总维生素C的浓度，μg/mL。

V——试样用10g/L草酸溶液定容的体积，mL；

m——试样的质量，g。

计算结果表示到小数点后两位。

6、说明及注意事项

①本方法为GB/T 5009.86--2003标准第二法，第一法为荧光法。此外还有2，6-二氯靛酚滴定法、高效液相色谱法等。

②全部实验过程应避光进行操作。

③加入85％硫酸后试管从冰水中取出，溶液的颜色会继续变深，所以必须计算好，加入硫酸后准时0.5h比色。

④硫脲可防止维生素C被氧化，且可帮助脎的形成，最终溶液中硫脲的浓度均需一致，否则影响色度。

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