盐渍辣椒真菌多样性分析（一）

盐渍辣椒制作过程中常添加15%以上的食盐，0.05%～0.1%的CaCl2及0.05‰～0.1‰的焦亚硫酸钠，因此该类辣椒保藏时间较长，且能保持较脆的辣椒口感，是剁辣椒加工过程中一类原料。盐渍辣椒的质量好坏，直接影响中、低盐再加工品的质量和安全。近年来，盐渍辣椒的标准化生产，中、低盐再加工品的提质以及盐渍辣椒的微生物多样性等逐渐引起从业人员的重视。

现阶段微生物多样性研究报道多集中在环境土壤湖泊等领域，而食品方向以酿酒领域居多，发酵蔬菜类以韩国泡菜居多，而发酵辣椒多样性研究鲜见。454焦磷酸测序技术测序已成熟应用到微生物菌落鉴定中，能有效分析出样品生态环境中原始微生物的组成及其比重。赵玲艳等研究发现线椒自然发酵过程中的真菌可归属到39个属、56个种，优势真菌为汉逊酵母属，米椒自然发酵过程中的真菌可归属到60个属、96个种，优势真菌为汉逊酵母属和毕赤酵母属。

本研究采用454焦磷酸测序技术研究盐渍辣椒中真菌多样性，以确定盐渍辣椒中真菌群落结构及相对丰度。在此基础上，研究盐渍辣椒细菌多样性，分析高盐腌渍辣椒过程中微生物群落结构及相对丰度的变化，为安全生产腌渍辣椒，保障产品质量，提高风味提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验原料

盐渍米椒（C.annuumL.var.dactylusM）、盐渍线椒（C.annuumL.var.conoidesＩrish），湖南坛坛香食品科技有限公司。

1.2 主要试验试剂

E.Z.N.A.SoilDNA试剂盒、TransStartFastpfuDNA聚合酶、AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒、RocheGSFLXTitaniumemPCR试剂盒、Manual_XLR70试剂盒，美国OmegaBio-Tek公司。

1.3 仪器与设备

DYY-6C型凝胶电泳仪，北京市六一仪器厂；GeneAmpR9700型PCR仪，美国ABＩ；QuantiFluorTM-ST荧光定量系统，美国Promega；RocheGSFLX测序仪，瑞士Roche。

1.4 方法

1.4.1 样品采集

本研究以盐渍线椒及盐渍米椒为对象，选择色泽、风味较好的样品，无菌操作取样带回实验室，-80℃冰箱保存。

1.4.2 理化指标的测定

总酸：参照GB/T12456-2008测定；NaCl：参照GB/T12457-2008测定；水分：直接干燥法测定；辣椒素：参照GB-T21266-2007测定。

1.4.3 样品中微生物DNA的提取

参照OMEGA公司E.Z.N.ASoilDNA试剂盒抽提方法提取DNA。

1.4.4 扩增产物定量及测序

正反向引物（27F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，533R5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’），带有5’端454测序A、B接头的特异引物和3’端的融合引物，其中A为测序端，需要加上条码（barcode），B端引物可以共用。PCR采用20μL反应体系。

1.4.5 PCR产物定量、测序

PCR产物荧光定量，要求总量＞100ng，要求PCR产物浓度>5ng/μL，OD260/280值在1.8～2.0左右，未降解，根据454RocheGS-FLX测序。

1.4.6 生物信息分析方法

数据采取Qiime软件去杂，生物信息学分析以去除嵌合体、分类学分析、OTU聚类、比对分析等。计算α多样性指数后，进行群落结构组分、绘制热图（Heatmap）、PCA分析、丰度等级（Rank-Abundance）和多样性（Shannon-Wiener）曲线绘制等分析。

2 结果与分析

2.1 盐渍米椒和线椒的理化指标测定结果

盐渍米椒和盐渍线椒的辣椒素、水分、总酸、食盐含量的变化见表1。从表1可以看出，盐渍米椒的辣椒素含量为26120SHU，水分含量为65.10%，总酸含量为0.82%，食盐含量为14.48%；盐渍线椒的辣椒素含量为2412SHU，水分含量为73.18%，总酸含量为0.15%，食盐含量为21.61%。

2.2 盐渍线椒和米椒细菌和真菌的稀疏性曲线

盐渍线椒和盐渍米椒细菌和真菌的稀疏性曲线见图1。由图1可以看出，当细菌测序量增加到5000，真菌测序量增加到2000左右时，测序数据达到饱和，试验设定细菌10000条序列、真菌5000条序列的测序深度是合理的。盐渍线椒细菌和真菌稀疏性曲线分别比盐渍米椒细菌和真菌的稀疏性曲线陡、高，盐渍线椒的细菌和真菌多样性分别高于盐渍米椒的细菌和真菌多样性。

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