赭曲霉毒素A标准检测方法（一）

赭曲霉毒素(Ochratoxins)是由曲霉属和青霉属的几个种产生的有毒代谢产物。在寒冷的气候下，产毒霉菌主要是纯绿青霉(P．uiridicatum)，而在温暖的气候下，产毒霉菌主要是赭曲霉(A.ochracatum)。赭曲霉毒素的基本化学结构是由异香豆素连接到p-苯基丙氨酸上的衍生物，有A、B、C、D四种化合物。赭曲霉毒素A(0chratoxin A．缩写OTA)的化学结构式为：

赭曲霉毒素B的分子结构中没有氯元素，赭曲霉毒素c是赭曲霉：荤素A的乙酯，赭曲霉毒素D是4-羟基赭曲霉毒素A。从对谷物的污染率、污染水平及对人畜的毒性考虑，OTA是重要的有卫生学意义的霉菌代谢产物。OTA是稳定的无色结晶化合物，溶于极性溶剂和稀碳酸氢钠溶液，微溶于水。将0TA的乙醇溶液贮于冰箱中一年以上也无损失，但应避光保存，如接触紫外线，几天就会分解。

OTA主要污染谷物和大豆，在动物饲料中OTA的污染率和污染水平远远超过供人食用的粮食。动物食用污染OTA的饲料，OTA蓄积于动物体内，在动物的肾、肝、肌肉和血液中都能检出OTA，人也可通过食用动物组织摄入OTA。OTA对实验动物的毒性主要表现为肾脏毒和肝脏毒，并有致畸和致癌作用。由OTA引起的天然发生的霉菌毒素病有丹麦和瑞典猪的霉菌毒素肾病，OTA也可能是巴尔干地区流行的人的地方性肾病的病因。世界粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会在第37次(1991年)报告中对OTA的毒性进行了评价，认为猪是最敏感的动物，肾是OTA作用的主要靶器官。应用对猪进行90d喂养试验的结果，评价人的OTA允许摄入量，用最低有作用水平每天0.0008 mg／kg体重和500倍的安全系数，在此基础上建立了每星期112μg／kg体重的暂时允许摄入量。我国还没有制定出OTA的卫生标准。据文献报导，食品(包括谷物、动物组织)中OTA的检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱法和酶联免疫吸附测定法。

一、薄层色谱法

(一)适用范围

本方法适用于小麦、玉米和大豆中OTA的测定。

(二)原理

用三氯甲烷-0.1mol/L磷酸或石油醚-甲醇/水提取样品中的OTA，样品提取液经液-液分配后，根据其在波长365nm紫外光灯下产生黄绿色荧光，在薄层色谱板上与标准比较测定含量。

(三)试剂

以下试剂除特殊规定外均为分析纯试剂，水为蒸馏水或同等纯度的水。

1、石油醚(60～90⁰C或30～60℃)；

2、甲醇；

3、三氯甲烷；

4、甲苯；

5、乙酸乙酯；

6、甲酸；

7、冰乙酸；

8、乙醚；

9、苯-乙腈(98+2)；

10、0.1mol/L磷酸[c(H₃PO₄)=0.1mol/L]：称取11.5g磷酸(85%磷酸)，加水稀释至1000mL；

11、2mol/L盐酸溶液[c(HCl)=2mol/L]：量取20mL盐酸，加水稀释至120mL；

12、4％氯化钠溶液；

13、0.1mol/L碳酸氢钠溶液[c(NaHCO₃)=0.1mol/L]：称取8.4g碳酸氢钠，加适量水溶解，并用水稀释至1000mL；

14、硅胶G；

15、赭曲霉毒素A标准溶液：用苯-冰乙酸(99+1)配成40μg/mLOTA贮备液，并用紫外分光光度计测定其浓度。最大吸收峰波长333nm，分子量403，摩尔消光系数值为5550)。精密吸取贮备液，用苯稀释成每毫升含OTAO.5μg。OTA标准溶液应置冰箱中避光保存。

(四)仪器

所有玻璃仪器均需用稀盐酸浸泡，依次用自来水、蒸馏水冲洗。

1、小型粉碎机；

2、电动振荡器；

3、玻璃板：5cm×20cm；

4、薄层涂布器：0.3mm；

5、展开槽：内长25cm，宽6cm，高4cm；

6、紫外光灯：波长365nm；

7、微量注射器：10μL，50μL；

8、具O.2mL尾管的10mL小浓缩瓶。

(五)操作步骤

1、样品溶液的制备

甲法：称取20g粉碎并通过20目筛的样品，置于200mL具塞锥形瓶中，加入10O mL三氯甲烷和10mL O.1mol/L磷酸，振荡30min后通过快速定性滤纸过滤。取20mL滤液置于250mL分液漏斗中，加50mL，0.1mol/L碳酸氢钠溶液振摇2min，静置分层后，将三氯甲烷层放入另一个100mL分液漏斗中(少量乳化层或即使三氯甲烷层全部乳化都可放入分液漏斗中)，加入50 mL0.1mol/L碳酸氢钠溶液，重复提取三氯甲烷层，静置分层后弃去三氯甲烷层(如三氯甲烷层仍乳化，弃去，不影响结果)。碳酸氢钠水层并入第一个分液漏斗中，加约5.5 mL2 mol/L盐酸溶液调节pH2～3(用pH试纸测试)，加入25mL三氯甲烷振摇2min，静置分层后，放三氯甲烷层于另一盛有100mL水的250mL分液漏斗中，酸水层再用10mL三氯甲烷振摇提取、静置，将三氯甲烷层并入同一分液漏斗中，振摇、静置分层，用脱脂棉擦干分液漏斗下端，放三氯甲烷层于一75mL蒸发皿中，将蒸发皿置蒸气浴上通风挥干，用约8mL三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解，转入具尾管的10mL浓缩瓶中，置80tC水溶锅上用蒸气加热吹氮气浓缩至干，加入0.2mL苯-乙腈(98+2)溶解残渣，摇匀，供薄层色谱点样用。

乙法：称取20g粉碎并通过20目筛的样品，加于200mL具塞锥形瓶中，加30mL石油醚和100mL甲醇-水(55+45)，在瓶塞上抹一层水盖严防漏。振荡30min后，通过快速定性滤纸滤入分液漏斗中，待下层甲醇水层分清后，取出20mL滤液，置于100mL分液漏斗中，用pH试纸测试，一般为5～6。加入25mL三氯甲烷振摇2min，静置分层后放出三氯甲烷层于另一个分液漏斗中，再用10mL三氯甲烷重复振摇提取甲醇水层(在用三氯甲烷振摇提取时，如发生乳化现象，可滴加甲醇促使其分层)，将三氯甲烷层合并于同一分液漏斗中，加入50～100mL4％氯化钠溶液(加入量视品种不同而异，大豆加100mL，小麦、玉米则加50mL左右)，振摇放置(如为大豆样品，还须轻轻反复倒转分液漏斗，使乳化层逐渐上升。如乳化严重，可加入少许甲醇)，待三氯甲烷层澄清后，用脱脂棉擦干分液漏斗下端，放三氯甲烷层于75mL蒸发皿中(如为大豆样品，须再加入10mL三氯甲烷振摇，三氯甲烷层合并于同一蒸发皿中)，将蒸发皿置蒸气浴上通风挥干。以下操作自“用约8mL三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解”起，按甲法操作。

参考资料：食品卫生微生物检验标准手册

相关链接：赭曲霉毒素A，赭曲霉毒素B，微量注射器