原创：食品中真菌毒素的检测

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真菌毒素是真菌生长过程中产生的代谢物，污染食品与农作物，给人的身体健康带来一定的危害，对农业生产具有巨大的危害性。了解常见的真菌毒素的危害及其检测方法，可以为进一步控制真菌毒素污染提供参考价值。

一、真菌毒素的概念

真菌：是一类有细胞壁，不含叶绿素，无根茎叶，以腐生或寄生方式生存，能够及进行有性或无性繁殖的微生物；

霉菌：是丝状比较发达的小型真菌的俗称；

真菌毒素：是由真菌产生的次级代谢产物。即由细胞增殖过程中形成的丙酮酸、酯酸、氨基酸等初级代谢产物作为前提物质，进行生物合成的物质。一般分为霉菌毒素和蘑菇毒素。

二、真菌毒素的种类

已知有200多种不同的真菌毒素，一般同时具有毒性强和污染频率高的特点。其中包括：黄曲霉毒素B1和M1 (Aflatoxins, FB1、FM1)；赭(棕)曲霉毒素A (Ochratoxin A, 0A) 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素) (Deoxynivalenol, DON)； 玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN(F-2)) ； T-2毒素(T -2 toxin,T-2)； 伏马霉素； 展青霉素(棒曲霉毒素) (Patulin, PTL)；杂色(柄)曲霉毒素(terigmatocystin)； 串珠镰刀菌素(Moniliformin, MF)三硝基丙酸； 二乙酰镳草镰刀菌烯醇(Diacetoxyscirpenol DAS)、麦角碱、黄米毒素、岛青霉毒素、橘青霉素、皱褶青霉素、黄绿青霉素、红矢精、黄绿素、圆弧青霉偶氮酸和F- 2毒素等。

（1）真菌毒素之黄曲霉毒素

黄曲霉毒素(Aflatoxins。简写AFT)是黄曲霉、寄生曲霉及温特曲霉等产毒菌株的代谢产物，是群结构类似的化合物。目前已发现17种黄曲霉毒素。根据其在波长为365nm紫外光下呈现不同颜色的荧光而分为B、G二大类:

B大类在氧化铝薄层板上于紫外光照射下呈现蓝色荧光；

G大类则呈绿色荧光。

（2）真菌毒素之赭曲霉素

毒性：主要对肾产生危害，造成肾肿大，当浓度超过5mg/Kg时，对肝脏组织和肠道产生破坏，引起肠炎等。无色结晶化合物，易溶于极性溶剂和稀的碳酸氢钠水溶液中，微溶于水，在紫外光照射下，呈绿色荧光，该化合物稳定，在乙醇中置冰箱避光保存一年以上而不被破坏，但在谷物中随时间延长而降解。

存在于：粮谷物、大豆、葡萄及葡萄酒、咖啡、可可和巧克力、中草药、调味料、啤酒等。

检测方法：薄层层析法、液相色谱法。

（3）真菌毒素之玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮也称F-2毒素。镰刀菌属的多个菌种如禾谷镰刀菌、三线镰刀菌、粉红镰刀菌、半裸镰刀菌、木贼镰刀菌、黄色镰刀茵、茄病镰刀菌、串珠镰刀菌等都可以产生该毒素。这些菌广泛存在于土壤、空气及污染的谷物中，主要污染玉米，也污染大麦、小麦、燕麦等。玉米的阳性检出率可达45%，最高含毒量可达2909 mg/蝇，小麦的阳性检出率可达20%，含毒量为0.36~11.05 mg/k。

检测方法：高效液相色谱法。

（4）真菌毒素之伏马菌素

自然界中最为普遍，毒性强，损伤肝肾功能白色粉末，易溶于水、甲醇、乙腈等溶剂，在甲醇溶液中不稳定，在乙腈水溶液中非常稳定。

检测方法：高效液相色谱法。

（5）真菌毒素之展青霉素

展青霉毒素是多种真菌的有毒代谢产物，该物质方面是一种广谱的抗生素，另一方面对小鼠、兔子等试验动物具有较强的毒性。其污染食品和饲料后产生的毒性远大于其抗菌作用。

（6）真菌毒素之杂色曲霉毒素

毒性：引起肿瘤

污染：小麦、大麦、玉米、花生、大豆、咖啡豆、火腿、奶酪等。易溶于氯仿、苯、吡啶、乙腈，微溶于甲醇、乙醇，不溶于水和碱性溶液。在紫外线照射下，呈砖红色荧光。

检测方法：薄层法，紫外分光光度计测定。

三、真菌毒素的检测

（一）前处理

1. 采样和样品的准备

（1）根据分析目的的不同确定采样地点，如：农田、仓库、加工厂、运输工具、零售商和医院等。

（2）采样方法：

静态样品：麻袋、箱柜和车厢等容器存放分样品均属静态样品。

采样工具：顶端尖锐的长柄采样钎子。

采样数量：小批量时采1/4；大批量时为整批麻袋数。

动态样品：用商品化的十字交叉切分自动采样器。

（3）采样量采大样，按四分法对角连续多次分样缩减至1 - 2kg，最后取代表样全部粉碎。美国农业部USDA的方法：成批样每批取3份大样，每份22kg。实验室分析用的样品为1- 5kg。

2.提取

（1）提取溶剂

溶剂的选择取决于待测毒素的种类、毒素性质、毒素在提取溶剂中的溶解度、提取溶剂的毒性价格、非测定成分在提取溶剂中的分配系数等。毒性小、极性大、价格低廉的溶剂系统。

常用溶剂：甲醇、氯仿、丙酮、己烷、乙酸乙酯、乙睛和水中一种或多种不同配比的混合物。

（2）提取温度

温度影响毒素的回收率，适当升高温度可以增加毒素的回收率。

（3）食品基质

固体食品：选用浸剂、洗脱、索氏回流等方法。

液体食品：液-液分配方法

3.纯化

纯化：在确保不损失待测毒素的前提下除去干扰杂质的过程称为纯化。

常用净化方法：液-固萃取、液-液分配、化学吸附、色谱法、透析法以及SFE法等。使用最广泛的是色谱法。

色谱法：薄层色谱法(柱色谱法最常用)

吸附色谱柱常用的吸附剂：硅胶、矾土、氧化铝、活性炭、弗罗里硅土。

分配色谱柱常用的填充剂：硅藻土、纤维素。

固相提取 (广泛采用) ；免疫亲和柱IAC (应用于农产品的新技术)。

（二）真菌毒素的检测方法

1.薄层色谱测定法

实验原理：样品经提取、净化、薄层分离后，某些真菌毒素在紫外光下，产生特定荧光，以标准品做参比，根据其在薄层上显示的荧光的最低检出量来定量。

适用范围：适合于本身能够产生荧光的真菌毒素。如：AFB、OTA

优点：经济、对设备和检验人员要求不高。

2.高效液相色谱法

实验原理：样品中的真菌毒素经柱层析分离后，通过测量色谱峰的面积定量。

优点：特异性强、灵敏度高、定量准确。

分析时应该考虑流动相、色谱柱、柱温和检测器等分析条件，找出最佳配比。

有荧光的用荧光检测器，B类单端孢霉烯族化合物本身不产生荧光，但C6位置上有酮基，可配紫外检测器检测。

应用：选择高效液相-荧光分光光度法是定量测定农产品中玉米赤霉烯酮污染最可靠、亦是最常用的方法。

3.免疫亲和柱-荧光计快速检测法

实验原理：利用抗原一抗体免疫反应的原理，使用大剂量的单克隆抗体，选择性的将样品提取液中的黄曲霉毒素吸附，用水将杂质洗脱除去，再用甲醇定量将黄曲霉毒素洗脱，达到分离净化目的。

免疫反应：指抗原和抗体分子的结合。抗原抗体复合物的形成要求二者结构有互补性，抗原与抗体的结合液因此具有高度特异性。

优点：高度特异性、高灵敏度、快速简便等。

4.快速检测卡检测法

检测原理：测定基础是抗原抗体反应，抗体连接在柱体内，样品经过提取、过滤后，缓慢的通过赭曲霉毒素的免疫亲和柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱，除去没有被结合的其他无关物质。用甲醇洗脱赭曲霉毒素A，然后再注入到分析仪器中用于检测。