非生物胁迫对橡胶树热激转录因子家族成员表达的影响（一）

热激转录因子在植物适应生物胁迫和非生物胁迫的过程中起着重要的调节作用，赋予植物多种抗逆性。热激转录因子家族成员序列大小不一，但结构域比较保守，主要包含N端高度保守的DNA结合结构域，它可识别并结合热激元件从而激活热激蛋白基因的转录；依次是寡聚化结构域，由2个疏水七肽重复区域组成，并通过一段可变长度的柔性序列连接到DBD。该结构域可促进与HSP启动子中HSE的结合，调控HSP的转录；接着是核定位信号和核输出信号，NLS是一簇碱性氨基酸区域，与进入细胞核有关。NLS和NES协同调控Hsfs在细胞核和细胞质中的分布；C端转录激活结构域含有短肽AHA基序，具有转录激活功能。根据Hsfs结构特点，将植物Hsfs分为3个主要亚家族。橡胶树Hsfs家族共30个成员，也分为HsfsA、B和C。Hsfs能够识别热激元件HSE并与之结合，从而激活下游基因如HSP的转录，响应生物胁迫和非生物胁迫。小麦热激转录因子TaHsfA6f调控一系列下游基因的转录，参与保护植物免受高温损伤。枇杷EjHsf1通过调节下游基因EjHSP的转录响应低温胁迫。拟南芥NPR1与HsfA1互作从而激活HsfA1参与低温胁迫反应。DREB2A能够调控HsfA3的表达进而响应盐胁迫和干旱胁迫。HsfA4a亦能提高拟南芥的耐盐性和耐氧化性。植物Hsfs家族成员较多，结构复杂，功能多样，响应于多种逆境交叉胁迫，是一类理想的遗传改良候选基因。

巴西橡胶树是重要的热带经济作物，原产于亚马逊河流域。目前，已大规模种植于南亚或东南亚以及赤道附近南北纬度10°之间的热带地区，该地区属于传统植胶区，无低温侵袭，且雨水充足。我国的橡胶树种植区位于热带北缘，属于非传统植胶区，经常遭遇寒潮侵袭，以及干旱危害。选育高产抗逆品种是保障我国天然橡胶高产稳产的有效途径。但是，由于橡胶树育种周期特别漫长，而且因缺乏高效的早期评选技术，高产性状和耐寒性状难于聚合，导致生产上的高产耐寒品种极度匮乏，严重影响我国天然橡胶产业的可持续发展。为了解决这一问题，可开发相应的分子标记辅助橡胶树的新品种培育，以及通过转基因技术提高高产橡胶树品种的耐寒性，创制新品种。本文分析了30个橡胶树Hsf家族成员在低温胁迫下橡胶树‘93-114’和‘热垦501’树叶中的表达模式，还鉴定了Hsf家族成员对干旱和高盐胁迫的响应。研究结果为进一步解析Hsf家族成员的抗逆机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

中国热带农业科学院橡胶研究所橡胶树种苗培育基地培育的橡胶树无性系‘93-114’和‘热垦501’袋装苗，处于稳定期一蓬叶幼苗。天根生化科技（北京）有限公司的RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒；Ferments公司的RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit反转录试剂盒；宝生物工程（大连）有限公司的SYBRPremixExTaq(TliRNaseHPlus)Ⅱ；其他生化试剂及耗材均为进口或国产分析纯试剂；引物合成由Invitrogen公司完成。

1.2 方法

1.2.1 材料处理

恒温培养箱（PGR15，COVVILN，加拿大）用于室内处理橡胶树幼苗，设定28℃培养箱处理对照材料，设定4℃培养箱低温处理材料，其他条件设置为：相对湿度为80%，光照强度为125μmol/(m²·s)，16h光照和8h黑暗。

低温胁迫的处理方法：将橡胶树无性系‘93-114’和‘热垦501’袋装幼苗转移至28℃恒温培养箱中预培养2d。然后把材料平均分为2组，以保留在28℃恒温培养箱中的一组作为对照，转移至4℃培养箱中的一组作为处理。在0、4、8、24h分别采集对照和处理的幼苗树叶。每个时间段采集5株幼苗树叶制成1个混合样，共3次生物学重复。

干旱胁迫的处理方法：将‘93-114’袋装苗在28℃预培养2d，然后平均分为2组，一组在28℃恒温培养箱中继续培养，另一组除掉袋子和泥土，裸根置于28℃恒温培养箱中培养，在0、2、4、8、12、24h分别收集叶片，每个时间段采集5株幼苗叶片制成1个混合样，3次生物学重复。

盐胁迫处理方法：将‘93-114’袋装苗在28℃预培养2d，然后平均分为2组，一组以400mmol/LNaCl溶液浇灌袋装苗1次，另一组浇灌同样体积的水，然后继续置于28℃恒温培养箱中，分别在0、2、4、8、12、24h6个时间段收集叶片，每个时间段采集5株幼苗叶片制成1个混合样，3次生物学重复。所有采集的样品都用于提取总RNA。

1.2.2 总RNA的提取与cDNA的合成

橡胶树叶片总RNA的提取参照天根生化科技（北京）有限公司的植物总RNA提取试剂盒的操作说明进行。cDNA第1链的合成根据Ferments公司试剂盒的操作步骤进行。

1.2.3 荧光实时定量PCR分析

采用Bio-Rad公司的CFX实时荧光定量PCR系统，实验操作按仪器使用说明书进行。合成的cDNA溶液稀释10倍后作为荧光定量PCR分析模板。反应体系10µL，包含模板1µL，2×SYBRPremix5µL和每条引物0.3µL，无菌水补足10µL。用于qPCR的Hsfs引物和内参HbActin7a引物参照Li等的文献。PCR反应程序为：95℃变性30s；95℃10s，60℃20s，72℃20s，共40个循环。40个循环后进行溶解曲线分析。利用CFXmanager3.0软件自动进行基线和Cq值分析，算法为2–^△△Cq法。

1.3 数据处理

采用T-test方法对基因表达水平进行差异显著性分析（P＜0.01为极显著差异）。

2 结果与分析

2.1 低温对热激转录因子基因表达的影响

依据橡胶树幼苗耐寒性室内评价鉴定体系，对30个橡胶树Hsfs家族成员在低温胁迫下‘93-114’和‘热垦501’叶片中的表达模式进行了分析。在30个橡胶树Hsf家族中，24个成员在‘93-114’叶片中的本底表达量显著高于‘热垦501’（图1）。在低温条件下，HbHsfA3b、HbHsfA4a、HbHsfA4d、HbHsfA5b、HbHsfA8a、HbHsfA9b、HbHsfC1a、HbHsfC1b、HbHsfB1a和HbHsfB2b在橡胶树‘93-114’和‘热垦501’叶片中均呈显著上调表达模式，其中HbHsfA4a、HbHsfA4d、HbHsfA9b、HbHsfC1a和HbHsfC1b在‘93-114’叶片中的表达量显著高于‘热垦501’。C亚家族中的2个基因HbHsfC1a和HbHsfC1b在‘93-114’和‘热垦501’叶片中的表达模式非常相似，对低温胁迫比较敏感。在‘93-114’和‘热垦501’叶片中均呈显著下调表达的基因有HbHsfA3a、HbHsfA4b、HbHsfA5a、HbHsfB4c和HbHsfB4d五个基因，但是这些基因在‘93-114’叶片中的表达量显著高于‘热垦501’。另外，还有7个基因在‘热垦501’中显著上调表达，而在‘93-114’中呈显著下调表达模式，其中HbHsfA7a和HbHsfB2c在‘93-114’中的转录水平依然高于‘热垦501’（图1）。

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