卵白蛋白体外模拟胃肠道消化产物的抗氧化活性及其结构表征（一）

鸡蛋富含多种优质蛋白质，是人们餐桌上常见的蛋白质来源。蛋白质主要分布在蛋清和蛋黄中，蛋清中蛋白以卵白蛋白、卵类黏蛋白、卵黏蛋白以及伴白蛋白等形式存在；蛋黄中蛋白以高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和肝素等形式存在。研究表明，鸡蛋中多种蛋白具有抗氧化活性，其中，卵白蛋白作为蛋清蛋白的主要成分，约占54%，是一种由385个氨基酸组成的糖蛋白，含有6个具有二硫键的半胱氨酸残基，是唯一含有游离硫醇基团（SH）的蛋清蛋白，因而卵白蛋白能与自由基直接反应，从而具有较强的抗氧化活性。Liu等为改善姜黄素的功能特性，利用卵白蛋白制成卵白蛋白-姜黄素复合物，与纯姜黄素相比，复合物的抗氧化活性提高。

目前对卵白蛋白抗氧化性的研究主要集中在酶解或改性前、后体外活性评价。卵白蛋白最终对人体的健康益处与其在体内的生物利用度密切相关。评价生物利用度有体内和体外两类模型，体内主要是动物模型。动物模型虽然能够真实地还原生理条件下的消化过程，但是存在以下问题：实验周期长，成本高，并且由于个体差异问题，容易造成结果的重复性差。评价卵白蛋白生物利用度的体外模型主要是体外模拟胃肠道消化模型，体外模拟消化能够在一定程度上模拟生理状况，并且试验易操作，成本低、周期短。

本试验以卵白蛋白及其体外模拟胃肠道消化产物为研究对象，探究卵白蛋白经体外模拟胃肠道消化后的抗氧化活性变化。测定其ABTS⁺·清除活性和ORAC，评价体外抗氧化活性。利用H₂O₂诱导Caco-2细胞氧化损伤，构建细胞氧化损伤模型，探究其体内抗氧化活性。以期阐明卵白蛋白经体外模拟胃肠道消化后抗氧化活性变化规律，为后续研究蛋白及其产物在体内消化、吸收提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

卵白蛋白、6-羟基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid，Trolox）、2’-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2’-azino-bis（3-ethylbenzoth-iazoline-6-sulfonicacid），ABTS）、2，2’-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（2，2’-azobis（2-methylpropi-onamidine）dihydrochloride，AAPH）、荧光素钠、细胞内ROS检测试剂盒等，美国Sigma公司；合成肽CFDV、CVSP、MPFR（纯度＞95%），生工生物工程（上海）股份有限公司；人结肠癌细胞（Caco-2），中国科学院上海细胞库；DMEM培养基，美国Gibco公司；H2O2（分析纯），北京化工厂；细胞增殖检测试剂盒（MTS），美国Promega公司。

1.2 仪器与设备

电子天平，瑞士METTLERTOLEDO公司；多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；黑色孔板（透明平底），德国GreinerBio-One公司；移液器，德国Eppendorf公司；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；二氧化碳培养箱，上海力申科学仪器有限公司；低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；倒置生物显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司；EASY-nLC1000液相色谱仪，美国ThermoScientific公司；OrbitrapEliteTM组合型离子阱Orbitrap质谱仪，美国ThermoScientific公司。

1.3 方法

1.3.1 体外模拟胃肠道消化

参照Alting等报道的方法并稍作修改。称取10g卵白蛋白，加入1L蒸馏水配制成质量分数1%的蛋白溶液。加质量分数2%的胃蛋白酶（EC3.4.23.1，来源于猪胃黏膜，酶活力为3000units），用1mol/L的HCl将pH值调至2，保持体系温度在37℃，持续酶解90min。用1mol/L的NaOH调pH值至7，加入质量分数4%的胰液（EC3.4.21.4，来源于猪胰腺，酶活力为250units），保持温度37℃和pH7，持续酶解4h。将体系沸水浴10min灭活蛋白酶，冷却至室温。将酶解液离心，在4℃下10000r/min离心10min，收集上清液，-20℃贮存备用。

1.3.2 卵白蛋白及其消化产物体外抗氧化活性测定

1.3.2.1 卵白蛋白及其消化产物ABTS⁺·清除能力测定

配制7mmol/LABTS溶液和4.9mmol/L的K₂S₂O₈溶液，将二者等体积混合配置得到ABTS储备液。将储备液于室温避光条件下静置12～16h后，用PBS将储备液稀释20～30倍，使其在734nm下的吸光度为0.7±0.02，形成ABTS工作液。96孔板按如下设置加入溶液：空白组：200μLPBS、对照组180μLABTS工作液和20μLPBS以及试验组：180μLABTS工作液和20μL样品溶液（0.5，1，5和10μg/mL），每组3个复孔。将96孔板放入酶标仪中，振荡10s后，室温静置5min后，测定反应体系在734nm下的吸光度值。计算ABTS自由基清除能力（%）的公式为：

式中：A₀—空白组的吸光度；A₁—对照组的吸光度；A₂—试验组的吸光度。

样品的ABTS自由基清除能力用Trolox抗氧化当量（TEAC，μmol/LTE/g样品）表示，即一定浓度的样品溶液相当于多少浓度的Trolox溶液。

1.3.2.2 卵白蛋白及其消化产物ORAC测定

配制116nmol/L的荧光素钠溶液和40mmol/L的AAPH溶液。在黑色96孔板中首先按如下设置加入溶液，空白组：120μL荧光素钠溶液和20μLPBS；样品组：120μL荧光素钠溶液和20μL样品溶液（10μg/mL）；Trolox组（标准品组）：120μL荧光素钠溶液和20μLTrolox溶液（1μg/mL），混合上述体系，在37℃下预热2min后，快速加入60μLAAPH溶液启动反应。将黑色96孔板立即放入酶标仪中，设置温度37℃，激发波长485nm，发射波长520nm，每隔2min振板10s并检测1次，连续测定600min。将每次测定值连成曲线，按下述公式计算荧光曲线下的面积：

式中：f₀—0min时的测定值；f_i—i，min时的测定值。Net，AUC按下述公式计算：

1.3.3 卵白蛋白及其消化产物的细胞抗氧化活性

1.3.3.1 卵白蛋白及其消化产物的毒性作用

Caco-2细胞按照参考文献的方法进行培养。将处于对数生长期的Caco-2细胞以2×10⁴cells/孔的密度接种于96孔板中，分别设置空白组、对照组和试验组，每个浓度6个复孔。空白组加入80μL的培养基，试验组和对照组加入80μL细胞悬液，于37℃、5%CO₂培养箱中孵育12h后，空白组和对照组加入10μLDMEM无血清高糖培养基，试验组分别加入10μL终质量浓度为0.01，0.1，1mg/mL的样品溶液，继续孵育12h后，各组均加入10μLDMEM无血清高糖培养基，孵育6h后，利用MTS法测定细胞存活率。

1.3.3.2 H₂O₂诱导Caco-2细胞氧化损伤模型的建立

Caco-2细胞按照参考文献的方法进行培养。将处于对数生长期的Caco-2细胞以2×10⁴细胞/孔的密度接种于96孔板中，分别设置空白组、对照组和试验组，每个浓度6个复孔。空白组加入80μL的培养基，试验组和对照组加入80μL细胞悬液，于37℃、5%CO₂培养箱中孵育12h后，各组均加入10μLDMEM无血清高糖培养基，继续孵育12h后，空白组和对照组加入10μLDMEM无血清高糖培养基，试验组分别加入10μL终浓度为400，500，600，700，800，900μmol/L的H₂O₂溶液，孵育6h后，利用MTS法测定细胞存活率。选取细胞存活率50%所对应的H₂O₂浓度为构建Caco-2细胞氧化损伤模型的最佳浓度。

1.3.3.3 卵白蛋白及其消化产物对Caco-2细胞氧化损伤的保护作用

Caco-2细胞按照参考文献的方法进行培养。将处于对数生长期的Caco-2细胞以2×10⁴细胞/孔的密度接种于96孔板中，分别设置空白组、对照组和试验组，每个浓度6个复孔。空白组加入80μL的培养基，试验组和对照组加入80μL细胞悬液，于37℃、5%CO₂培养箱中孵育12h后，空白组和对照组加入10μLDMEM无血清高糖培养基，试验组分别加入10μL终质量浓度为0.01，0.1，1mg/mL的样品溶液，继续孵育12h后，空白组和对照组加入10μLDMEM无血清高糖培养基，试验组加入10μL终浓度为700μmol/L的H₂O₂溶液，孵育6h后，利用MTS法测定细胞存活率。

相关链接：6-羟基-2，胃蛋白酶，荧光素，白蛋白

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