“瘦肉精”盐酸克伦特罗中毒样品的气相色谱-质谱分析测定

“瘦肉精”，化学名为盐酸克伦特罗，是一种白色或类似白色的结晶体粉末，无臭，略有苦味，可溶于水、乙醇、甲醇，化学性质稳定，加热到172℃时才能分解。大鼠经口LD₅₀为159mg/kg。

盐酸克伦特罗是一种β-受体兴奋剂类药物，有松弛支气管平滑肌的作用，早期用于治疗哮喘。几十年前，人们意外发现：饲料中添加了适量的盐酸克伦特罗后，可使猪等禽畜生长速率加快、改善动物体内脂肪分配、提高饲料转化率、瘦肉率提高10％以上，“瘦肉精”的俗称正是由此而来，“瘦肉精”进入动物体内后主要分布于肝脏，肌肉中含量较肝脏低很多。这种药物在胃肠道内吸收快，人或动物服后15～20min即起作用。作为兽药或禽畜饲料添加剂，则属于违禁品。

 盐酸克伦特罗中毒途径主要为经口摄入，大多数为食源性中毒，人们如果食用了曾经大量喂食过“瘦肉精”的动物，尤其是动物肝脏，容易发生中毒事件，由于盐酸克伦特罗化学性质稳定，加热到172℃时才能分解，因此一般的加热方法不能将其破坏。全国各地已有多起中毒事件发生，中毒的不良反应和主要症状：心慌、心悸、胸闷、头痛、面色潮红、四肢震颤、视力模糊、肌肉震颤以及脸部潮红等。多数案例是由于食用了曾经喂食过盐酸克伦特罗的禽畜引起。

盐酸克伦特罗的测定方法有酶联免疫法、胶体金免疫层析法，可用于快速筛查，气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法可提供盐酸克伦特罗化合物的质谱图，为确认方法，国家标准方法有GB/T 5009.192—2003(动物性食品中克伦特罗残留量的测定》，GB/T 22286—2008(动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定  液相色谱串联质谱法》，GB/T21313—2007《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量检测方法  液相色谱-质谱/质谱法》。

案例6：2010年某地一家四口食用午餐后，有3人发生心悸、心动过速、胸闷气短、头痛面色潮红、四肢震颤、视力模糊等症状，临床医生根据临床症状怀疑为“瘦肉精”引起的食物中毒。经现场流行病调查：该户居民自当地超市购买了：凉菜、熟食、猪肝等作为一家人当日午餐，一家四口同时进食，未食用猪肝的儿子未发病，女主人平时喜爱食用猪肝，本次食用量最大，中毒症状最严重，初步判定可疑食物为猪肝，超市当日批次猪肝已经全部售出，采集该居民家剩余猪肝送实验室检验。

仪器与耗材：气相色谱-质谱仪，配有自动进样器和电子轰击源(EI)；分析天平；旋转蒸发仪；离心机；涡旋混匀器；氮吹浓缩仪；超声波清洗器；恒温干燥箱。

试剂与材料：所有试剂除另有说明外，均为分析纯，试验中所用水均为二次蒸馏水。异丙醇(色谱纯)；乙酸乙酯(色谱纯)；磷酸二氢钠(分析纯)；高氯酸(分析纯)；氢氧化钠(分析纯)；弱阳离子交换柱(LC-WCX，3mL)；无水硫酸钠(分析纯)：经5500C烘烤4h，储存于干燥器中，冷却后备用；双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)99％+三甲基氯硅烷(TMCS)1％；乙醇(分析纯)；浓氨水(分析纯，要求新)；甲苯(色谱纯)；甲醇(色谱纯)；盐酸克伦特罗标准品(99.8％，Sigma公司)；美托洛尔(99.8％，Sigma公司)。

仪器条件：色谱柱，DB-5MS石英毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；色谱柱升温程序，初始温度75℃，保持1min，以200C/min升温至200℃，保持5min，再以20℃/min升温至250℃；载气，高纯氦气，恒流模式，流速为1.0mL/min；进样模式，不分流进样；进样体积1μL；电子轰击源(EI)，能量70eV；离子源温度230℃；选择离子监测方式，盐酸克伦特罗衍生物特征离子m/z 86、m/z 187、m/z 243、m/2 262；美托洛尔衍生物特征离子m/z 72、m/z 223；传输线温度280℃；溶剂延迟8min。

样品处理：按照GB/T 5009.192—20036动物性食品中克伦特罗残留量的测定：《气相色谱-质谱法》，称取粉碎后样品10g，(精确至0.01g)，用20mL 0.1mol/L高氯酸溶液匀浆，置于50mL离心管中，超声提取20min，取出置于80⁰C水浴中加热30min，冷却后5000r/min离心15min，取出上清液，沉淀用5mL 0.1mol/L高氯酸溶液洗涤，再离心，将两次的上清液合并。用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至(9.5±0.1)，再离心，将上清液转移至磨口玻璃离心管中，加入8g氯化钠，混匀，加入25mL异丙醇+乙酸乙酯(40+60)，置于振荡器上振荡提取20min。静置待分层，用吸管取出上层有机相，再用20mL异丙醇+乙酸乙酯(40+60)重复萃取一次，合并有机相，氮吹至近干，用1mL0.1mol/L磷酸二氢钠缓冲液(pH6.O)充分溶解残留物，经针筒式微孔过滤膜过滤，洗涤三次后完全转移至5mL玻璃离心管，并用O.1mol/L磷酸二氢钠缓冲液(pH6.O)定容至刻度。

净化：依次用10mL乙醇、3mL水、3mL磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0)、3mL水冲洗弱阳离子交换柱(LC-WCX，3mL)，取2mL萃取液加至弱阳离子交换柱上，弃去流出液，分别用4mL水和4mL冲洗柱子，弃去流出液，用6mL乙醇+浓氨水(98+2)冲洗柱子，收集流出液，将流出液氮气吹干

衍生化：于净化、吹干的样品提取液残渣中加入200μL甲醇、50μL2.4mg/L的美托洛尔内标使用液，混匀，氮气吹干，迅速加入50μL衍生剂BSTFA99％+TMCSl％，在涡旋式混合器上混匀1min，置于75℃的恒温加热器中衍生30min。衍生反应完成后取出冷却至室温，在涡旋式混合器上混匀30s，用氮气吹干，加人200μL甲苯，在涡旋式混合器上混匀，待气相色谱-质谱分析。同时用克伦特罗标准使用液做标准系列同步衍生。

 结果与讨论：①在送检猪肝中检出克伦特罗，在上述分析条件下，克伦特罗衍生物的保留时间是14.02min，美托洛尔衍生物的保留时间是15.76min。猪肝样品提取物的总离子流图见图3—10，克伦特罗衍生物的质谱图见图3—11，克伦特罗标准的质谱图见图3—12。②样品前处理是生物样品分析方法中关键的步骤，肝脏是主要的代谢器官，含有大量的代谢物、血细胞、蛋白质等，容易干扰目标化合物的测定，复杂的前处理步骤就是为了尽可能地去除干扰。③质量控制：在样品前处理液进样前必须进甲苯溶剂，以确认进样针和气相色谱-质谱仪器系统未受到污染；要进行样品空白试验，即除不加样品外，其余操作完全同样品的，从用20mL 0.1mol/L高氯酸溶液匀浆，到开始提取、净化、衍生，按照上述气相色谱一质谱条件进样分析，保证在克伦特罗衍生物的保留时间14.02min处没有出现3倍噪音以上峰，以确保在复杂冗长的前处理过程中没有因溶剂中微量杂质浓缩而产生干扰；样品的定性一是保留时间与克伦特罗标准的保留时间一致；二是样品的克伦特罗的质谱图与标准的质谱图对比，m/z 86是基峰、丰度为100％，m/z 262丰度是基峰的15％，允许偏差在±20％内，m/g 243和m/z 187丰度约是基峰的6％，允许偏差在±50％内；三是样品测定液中的克伦特罗衍生物的色谱峰形与标准溶液中克伦特罗衍生物的色谱峰形一致。

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