超声萃取-高效液相色谱分析法测定土壤中2-氯-6-（三氯甲基）吡啶（一）

2-氯-6-（三氯甲基）吡啶（nitrapyrin，CP）是一种白色晶状固体物质。Goring报道了CP具有硝化抑制特性，CP施用到土壤后可显著抑制硝化细菌的活性，延缓铵态氮向硝态氮转化，减少氮素的淋溶和温室气体排放，从而提高了氮素利用率，增加了作物产量。由于使用CP后，易被土壤吸附而降低其有效性，土壤对CP的吸附作用是影响其在土壤环境中有效性的重要因素，因此建立可同时测定不同类型土壤中CP含量的方法具有重要意义。

高效液相色谱法常用于土壤中有机物的定量分析，该方法成熟、准确度较高.张玉敏等研究了甲基吡啶的高效液相色谱分析方法；王岙等通过液相色谱法同时测定两种农药，解决了用气相色谱法和质谱法存在保存期短、处理步骤繁琐及二者分离较难的问题。目前多采用高效液相色谱法分析吡啶类物质，利用反相色谱柱和极性流动相，根据不同吡啶类物质在反相柱的吸附力不同进行分离，不需要高温气化，测定更易实现。土壤中有机物的提取方法主要包括索氏提取、超声萃取和压力萃取等，其中索氏提取法提取率较高，但存在耗时、有机溶剂消耗量大及操作复杂等缺点；压力萃取需配备专用仪器，成本较高；超声波提取操作简单、节能且省时省力。超声萃取-高效液相色谱分析法操作简单，成本较低，由于CP化合物的极性为中性，沸点较低，其在土壤中的提取和含量测试方法目前尚未见文献报道。因此本文用超声萃取-高效液相色谱法测定土壤中的CP，用AgilentSB-C18色谱柱，优化流动相最佳体积比和最佳流速，测定不同土壤类型中CP的质量浓度。

一、材料与方法

1、仪器与试剂
高效液相色谱仪（安捷伦1260型，美国安捷伦公司）：六通阀进样器、紫外检测器和色谱柱（AgilentSB-C18不锈钢柱（4.6mm×150mm，5μm））；高速冷冻离心机（Z36HK型，德国HERMLE公司）；恒温水浴振荡器（SHA-C型，常州华普达仪器有限公司）。CP乳油（质量分数30%，实验室制备）；CP微囊悬浮剂（质量分数10%，实验室制备）；甲醇、乙醇和乙腈（色谱纯，上海国药集团化学试剂有限公司）；CP原药（质量分数≥98.0%，上海甄准生物科技有限公司）；CP标准品（质量分数≥99.0%，德国LGCLabortG-mbH·Bgm公司）；实验用水均为二次去离子水。

2、供试土壤

选择草甸黑土、黑钙土和风沙土3种供试土壤.在吉林农业大学农业科学试验站采集草甸黑土；在吉林省农安县农田采集黑钙土；在吉林省梨树县农业科学试验站采集风沙土。样品采集地点均为连续多年种植玉米的土地，且无硝化抑制剂CP的使用记录，土壤采样深度为0～20cm，自然风干，剔除动植物残体，过2mm筛，于密封袋中保存备用。3种供试土壤的基本性质列于表1。

3、方法

（1）流动相条件：用高效液相色谱法测定氯化产物及产品中CP的质量比。将流动相设为：V（甲醇）：V（水）=9，V（甲醇）：V（水）=4，V（甲醇）：V（水）=7∶3；V（乙腈）：V（水）=9，V（乙腈）：V（水）=4，V（乙腈）：V（水）=7∶3。测定CP标准溶液（50mg/L）的色谱图。

（2）检测波长用紫外检测器在190～400nm内对CP标准溶液（50mg/L）进行紫外区光谱扫描。

（3）流动相流速，用高效液相色谱法测定氯化产物及产品中CP的质量浓度。考虑土壤浸提液中杂质与CP的分离效果，将流动相流速分别设为0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4mL/min，考察不同流速对CP色谱峰峰型和保留时间的影响。

（4）标准曲线制作用分析纯乙醇和CP标准品分别配制0，2，5，10，20，25，45，75mg/L的CP溶液，以CP质量浓度和对应峰面积绘制标准曲线。

4、测定方法评价指标

（1）检出限对空白土壤样品连续进样测定20次，根据峰面积计算标准偏差，按计算检出限。其中：D为检出限；q为标准偏差；S为方法的灵敏度，即回归线方程的斜率。

（2）准确度和精密度

①在最佳测定条件下，对CP标准溶液重复进样10次，计算标准偏差和变异系数。

②在3种土壤（CP无检出）中分别添加低质量浓度（25mg/L）和高质量浓度（75mg/L）的CP标准溶液，m（固）∶V（液）=5，重复3次，于25℃恒温培养箱中培养24h，取1.50g于碘量瓶中，先分别用15，15，5mL分析纯乙醇各超声10min提取土壤中的CP，再于10000r/min离心，上清液用0.45μm有机滤膜过滤，低温（-20℃）保存备用，在最佳测定条件下测定不同类型土壤中CP的质量比，计算标准偏差和变异系数。

③选择CP乳油和CP微囊悬浮剂两种剂型，分别称取土壤10.00g，在土壤中分别添加2mL质量浓度为50mg/L不同剂型的CP水溶液，充分混匀，重复3次，于25℃恒温培养箱中培养24h，取1.50g于碘量瓶中，先分别用15，15，5mL分析纯乙醇各超声10min提取土壤中的CP，再于10000r/min离心，上清液用0.45μm有机滤膜过滤，低温（-20℃）保存备用，在最佳测定条件下测定不同剂型中CP的质量比，计算标准偏差和变异系数。

5、数据处理方法用SPSS17.0软件处理数据，用单因素方差分析法分析差异显著性（Duncan新复极差法，p＜0.05），用Oringe8.5软件绘制图表，通过色谱工作站（ChemStationEditionforLCandLC/MSsystems，C0.01.05）处理数据。

二、结果与讨论

1、优化CP测定条件

当用色谱法分析吡啶类物质时，选用C18色谱柱较多。由于高效液相色谱法测定吡啶类物质时的色谱柱类型、流动相、流速和检测波长等均显著影响样品的测定准确度，因此本文研究不同流动相及不同比例、流动速度和检测波长等因素对CP质量比测定的准确度、精密度和检测限的影响，并用超声萃取法测定不同类型土壤中的CP质量比。

（1）检测波长的选择

当温度为25℃，V（乙腈）V（水）=4的溶液为流动相，流速为0.8mL/min时，CP标准溶液（50mg/L）的紫外光谱如图1所示。由图1可见，在λ=285nm处有强吸收峰，为芳香环体系特征吸收峰，因此在该波长处的检测灵敏度较高，可作为CP的检测波长。

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