栀子根结线虫病的病原鉴定（二）

2 结果与分析

2.1 栀子根结线虫病症状

调查发现贺州市栀子种植基地部分栀子出现植株矮小，叶片黄化失绿，生长缓慢，严重的整株枯死等症状。受害植株根部形成大小不一的根结，根部表面坏死呈疏松孔状（图1）。取根组织在体视显微镜下观察可见大小不一的卵囊，切开卵囊见椭圆形卵块，根结组织内发现梨形的雌虫。采用改良贝曼漏斗分离根际土壤可分离到大量根结线虫二龄幼虫。

2.2 形态学特征

雌虫：虫体乳白色，梨形；颈部突出，与体分界明显；阴门和肛门位于末端；会阴部为指状花纹；侧尾腺口点状，位于肛门两侧靠前位置；口针细长，椎体部向背面略弯曲与杆部等长；口针基部球较小，形成两个球状。中食道球卵圆形，瓣门近似圆形；排泄孔位于中食道球前口针基部稍后位置（图2A）。会阴花纹近卵圆形或椭圆形；背弓较高，线纹较细且平滑，外侧线纹呈波浪状；具1～2条不太明显侧线；；腹面线纹纤细光滑，尾部较明显（图2B）。

二龄幼虫：线形，身体体环清晰明显，头架骨化弱，唇区缢缩不明显；排泄孔位于半月体后；口针细长，基部较大且为圆球形；中食道球卵圆形；尾部透明区分界明显，尾部缢缩明显，尾尖钝圆或细圆（图3），其测量值见表1。

本研究中广西贺州种群形态特征和测量值与象耳豆根结线虫原始报道基本一致，故定为象耳豆根结线虫。

2.3 分子特征

利用通用引物F194/PXB481和D2A/D3B分别对二龄幼虫核糖体ITS区域及28SrDNAD2D3区进行扩增，得到约700bp的片段，PCR产物扩增如图（图4）。经双向测序和拼接获得ITS片段大小为757bp，GenBank登录号为MH756121、MH756122，与国内报道的福建、湖南、海南及越南象耳豆根结线虫（M.enterolobii）群体的序列相似度是100%；与近似种南方根结线虫（M.incognita）ITS（MH113856）的序列相似度为90%，与花生根结线虫（M.arenaria）ITS序列（LC030356、LC030350）的序列相似度分别为88%和90%；与爪哇根结线虫（M.javanica）ITS序列（AY438555、KX646187）的序列相似度均为88%。扩增的28SrDNAD2D3区片段大小分别为764bp和716bp，GenBank登录号为MN648519和MN648520，其中MN648520与国内报道的广东、福建，及美国、泰国象耳豆根结线虫（M.enterolobii）群体的序列相似度为100%，MN648519与美国象耳豆根结线虫（M.enterolobii）群体的序列相似度为100%，和中国福建、广东及泰国象耳豆根结线虫（M.enterolobii）群体的序列相似度为99%；MN648519与近似种花生根结线虫（M.arenaria）和爪哇根结线虫（M.javanica）D2D3区片段（AF435803、MT3412991）的序列相似度均为94%；MN648520与花生根结线虫（M.arenaria）和爪哇根结线虫（M.javanica）D2D3区片段（AF435803、MN096736）的序列相似度分别为95%和94%。该结果进一步表明该病原线虫为象耳豆根结线虫（M.enterolobii）。

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