比较基因组分析Yarrowia lipolytica BBE-17的赤藓糖醇合成机制（一）

一、前言

赤藓糖醇是一种四碳糖醇，是目前唯一通过发酵法工业化生产的“零热量”糖醇类甜味剂1990年，日本食品法规批准赤藓糖醇作为直接食品配料；1997年美国食品药品监督管理局将赤藓糖醇列入GRAS（Generally Recognized as Safe）清单，允许在标签上标注“有益于牙齿健康”，1999年6月，世界粮农组织（JECFA）和世界卫生组织（WHO）联合组成的食品添加剂专家委员会（FAO）批准赤藓糖醇作为食用甜味剂，无需规定每日允许摄入量（ADIh1999年11月，澳大利亚和新西兰食品监督局（ANZFA）批准赤藓糖醇作为食用配料《我国卫生部2007年12号公告，批准赤藓糖醇为食品添加剂。为控制肥胖，减少人们对糖的摄人，2016年10月11日，世卫组织呼吁各成员国及地区针对糖饮料产品加征税费，这也促进了人们对赤藓糖醇的认识。作为一种“零热量”天然健康甜味剂，赤藓糖醇越来越受到食品饮料制造商和消费者的青睐。

亚罗解脂酵母（Yarrowia lipolytica）与酿酒酵母亲缘关系较远的非常规酵母，有6条染色体和一条线粒体DNA。它作为食品安全菌，已通过美国食品药品监督管理局的GRAS(Generally Recognized as Safe）认证。作为有潜力的工业微生物，近年来被用作宿主生产油脂、a-酮戊二酸以及番茄红素等多种产品或天然化合物。现有利用亚罗解脂酵母生产赤藓糖醉的报道，多是从菌种选育或途径改造方面进行研究，从基因组层面分析赤藓糖醇合成代谢的研究还十分匮乏。代谢产物的积累不仅和直接代谢途径相关，与细胞全局变化也是分不开的，这也是基因组重排（GenomeShuffling）等技术能成功用于目标菌株选育的原因，所以从基因组角度进行全局分析也是十分必要的。

Yarrowia lipolylica BBE—17是一株可积累赤藓糖醉的酵母，具有产业化生产赤藓糖醇的潜力。本文以模式菌株Yarrowia lipolytica CLIB122为对照，从弟核苷酸多态性（SNP）、小片段插入和缺失（InDel）、基因组结构变异（CV）、DNA拷贝数变异（CNV）、赤藓糖醉途径基因的分析等多个方面进行比较基因组分析，全面阐述了Yarrowia lipolica BBE-17与模式菌株基因组的差异情况，为进一步优化亚罗解脂酵母生产赤藓糖醇提供了思路和理论依据。

二、材料与方法

1、菌株与培养基

Yarrowia lipolytica BBE-17，江南大学生物系统与生物加工工程研究室自有菌株。YPD培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，固体培养基再添加20g/L的琼脂粉。菌株培养：挑取一环—800C保存的甘油管菌株，接种在装有2mLYPD培养基的摇管中，300C培养20h，用移液枪吸取lmL菌液转接至装有50mLYPD培养基的500mL三角瓶中，培养20h，5000r/min离心5min，弃上清，收集菌体，用于基因组提取。

2、基因组提取与测序

基因组提取参照试剂盒厂家提供的说明书，釆用的试剂盒为：高效植物基因组DNA提取试剂盒DP350，批号DP150906，天根生化科技（北京）有限公司。具体方法为：将通过2.1收集的亚罗解脂酵母菌体装在50mL离心管中置于液氮中快速冷冻，然后将菌体取出，用研钵快速研磨，研磨过程始终保持有液氮对菌体进行保护。研磨5min后，取丨OOpL菌体置于1.5mL离心管中，接下来按照试剂盒DP350说明进行操作。在对吸附柱上的基因组DNA进行洗脱时，采用的是30PL双蒸水。提取的基因组DNA快速放在液M下冷冻保存，防止降解。

3、比较基因组分析

测序仪Reads覆盖度分析：使用BWA软件把Reads比对到参考序列上，并使用SAMTOOLS软件对比对结果进行解析，统计Reads对参考序列的覆盖度。单核苷酸多态性与小片段插入缺失分析（SNP/InDel）：采用SAMTOOLS软件进行检测，并分析SNP/InDe丨在基因组功能区域上的变异情况。结构变异分析（SV）：利用BreakDancerM软件检测样品与参考基因组间的插入（INS）、缺失（DEL）、倒罝（INV）、染色体内部迁移（ITX）、染色体间的迁移（CTX）。DNA拷贝数变异分析（CNV）：使用CNVnator软件检测样品与参考基因组间的序列拷贝数变异。全基因组变异图谱分析（WGMP）：结合每个样品的测序Reads对参考序列的覆盖情况和SNP、InDel的分析结果，以参考序列为标尺，使用Circos软件把Reads薄盖情况和SNP、InDel的分布情况展示到环形的变异图谱上。

三、结果

1、高通置测序仪Reads与参考基因组的比对情况

参考基因组釆用的是Dujon等人公布的Yarrowia lipolytica CLIB122基因组数据（GenBank：GCA_000002525.1），经比对分析确认，样品基因组的Reads的平均深度为68（图1），其中Reads深度大于10的占98.67%（图2）。从测序Reads的质量来看，满足比较基因组测定要求，可用于进一步数据分析。

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