高效液相色谱-质谱联用法测定二甲双胍格列本脲(I)中N-亚硝基二甲胺

基因毒性杂质又称遗传毒性杂质，在痕量下即可损伤人类的DNA，具有一定的致癌性和致突变性，严重威胁人类的健康。N-亚硝基二甲胺（NDMA）是一种常见的N-亚硝胺类化合物，多来源于消毒剂、添加剂等生产过程中的副产物，普遍存在于水、食品、烟草中，NDMA毒性强，具有致癌、致畸和致突变作用。自从缬沙坦中检测出N-亚硝胺类基因毒性杂质后，为保证药品的质量和安全性，N-亚硝胺类基因毒性杂质的检测便备受国内外药监部门的关注。近年来，企业对药品中基因毒性杂质的控制越来越严格，检测药品中N亚硝胺类基因毒性杂质的研究方法逐渐增多，如高效液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-串联质谱法和气相色谱-串联质谱法等。
二甲双胍格列本脲片（I）是口服的复方降糖药，其疗效好、用量少、副作用低，主治经饮食控制、运动和服用二甲双胍或者磺脲类药物仍未不能控制血糖的Ⅱ型糖尿病。目前，仅见盐酸二甲双胍缓释片中N-亚硝胺类基因毒性杂质检测的报道，而二甲双胍格列本脲片（I）中NDMA的检测至今尚未见报道。为确保药品质量及其应用的安全，应严格控制药品中的基因毒性杂质。笔者建立了检测二甲双胍格列本脲片（I）中基因毒性杂质NDMA的高效液相色谱-质谱联用法，为药品的质量控制提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱-质谱联用系统：LC-30AD型高效液相色谱仪，日本岛津公司。质谱仪：TripleQuad6500型，美国ABSCIEX公司。电子天平：XS105型，感量为0.01mg，瑞士梅特勒-托利多公司。N-亚硝基二甲胺对照品：含量为99.9%，批号为1681903，美国TMstandard公司。二甲双胍格列本脲片（I）：批号分别为2011030304、2011040304、2011020304，市售。甲醇、甲酸：色谱纯，赛默飞世尔科技中国有限公司。实验用水为超纯水。

1.2 溶液的配制

N-亚硝基二甲胺对照品储备溶液：精密称定N亚硝基二甲胺对照品25mg，置于25mL容量瓶中，加适量甲醇溶液使其溶解，并稀释至标线，摇匀，制成质量浓度为1mg/mL的对照品储备溶液。分析前用甲醇稀释成所需浓度。

样品溶液：取二甲双胍格列本脲片（I）20片，研细，精密称取细粉500mg，置于10mL容量瓶中，加入适量甲醇溶液振摇使其溶解，用水定容至标线，摇匀，即得。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：ACEC18-HL色谱柱（150mm×4.6mm，5μm，广州菲罗门科学仪器有限公司）；柱温：40℃；流动相：A相为0.1%甲酸-水溶液，B相为甲醇；梯度洗脱：洗脱程序列于表1，流量为0.6mL/min；进样体积：5μL。

1.3.2 质谱条件

离子源：大气压化学电离源（APCI源）；检测模式：正离子模式检测；扫描模式：多反应监测模式（MRM）；离子源温度（TEM）：350℃；脱溶剂气流量：35mL/min；NC电流：3μA；气帘气（CUR）：206.8kPa；雾化气（GS1）压力：241.3kPa。

2 结果与讨论

2.1 溶剂的选择

二甲双胍格列本脲片（I）中含有辅料羟丙甲纤维素，其溶于水及大多数极性溶剂，然而羟丙甲纤维素在水中会溶胀成澄清或微浊胶体溶液，严重影响盐酸二甲双胍的溶解性，故应避免使用水作为溶剂。试验考察了甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基亚砜、四氢呋喃、三氯甲烷和甲苯的溶解性和适用性，最终选择甲醇作为溶剂。

2.2 耐用性考察

改变流量、柱温、流动相B的初始比例考察建立方法的耐用性。结果表明，微调流速、柱温、流动相B的初始比例后，基因毒性杂质N-亚硝基二甲胺的测定值基本一致，说明该方法中的色谱条件耐用性良好。

2.3 系统适应性试验

N-亚硝基二甲胺对照品溶液、样品溶液和溶剂，按1.3.1色谱条件进样分析，记录色谱图，样品溶液色谱图见图1，N-亚硝基二甲胺加标色谱图见图2。由图1、图2可知，在该色谱条件下，N-亚硝基二甲胺色谱峰形较好，且溶剂不干扰测定，说明该方法的专属性较好。

2.4 线性关系、检出限与定量限

精密量取1.2对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、5、10mL置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至标线，制成质量浓度分别为1、2、5、10、50、100ng/mL的标准工作液。将上述溶液分别注入液相色谱-质谱仪，按1.3.1色谱条件进样分析，记录色谱图，以N-亚硝基二甲胺对照品溶液质量浓度为横坐标（X），以色谱峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归分析，计算得到线性回归方程Y=75391X+44066，相关系数r=0.9998，N-亚硝基二甲胺的质量浓度在1.0268～102.68ng/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好。

1.2对照品溶液逐步稀释成不同浓度，按1.3色谱条件进样分析，连续测定6次，记录色谱图，以信噪比S/N=3和S/N=10分别确定检出限（LOD）和定量限（LOQ）。结果表明，N-亚硝基二甲胺的检出限和定量限分别为0.0342ng/mL和0.10268ng/mL。

2.5 加标回收试验

精密称取样品约100mg，共9份，置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解，再分别精密加入N-亚硝基二甲胺对照品溶液0.2、0.5、1.0mL各3份，加溶剂定容至标线，摇匀。按1.3色谱条件进样分析，记录色谱图，计算加标回收率，结果列于表2。由表2可知，N-亚硝基二甲胺的平均回收率为96.32%，测定结果的相对标准偏差为8.5%，表明本法的回收率良好。

2.6 稳定性试验

1.2制备N-亚硝基二甲胺对照品溶液。称取样品溶液约100mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解，再精密加入N-亚硝基二甲胺对照品溶液0.2mL，加甲醇定容至标线，摇匀，制备成N-亚硝基二甲胺加标溶液。取室温下放置0、1、2、3、6、10h后的对照品溶液和加标样品溶液，按1.3色谱条件进样分析，记录色谱图，以N-亚硝基二甲胺的色谱峰面积考察溶液稳定性，结果列于表3。

由表3可知，N-亚硝基二甲胺对照品溶液色谱峰面积的相对标准偏差为0.3%，而加标样品溶液中色谱峰面积的相对标准偏差为0.7%，表明上述两种溶液在10h内稳定性良好。

2.7 样品测定

取适量二甲双胍格列本脲片（I）（批号分别为2011030304，2011040304，2011020304），按1.2配制样品溶液，按1.3色谱条件分析，采用标准曲线法计算含量。结果表明，3批二甲双胍格列本脲片（I）中均未检测出基因毒性杂质N-亚硝基二甲胺。

3 结语

建立了高效液相色谱-质谱联用法检测二甲双胍格列本脲片（I）中的基因毒性杂质N-亚硝基二甲胺，该方法操作简便、灵敏、准确、重复性好。可用于监控二甲双胍格列本脲片（I）中基因毒性杂质的水平，不仅为其质量控制提供参考，还能够确保药品的安全性，具有实际应用价值。

相关链接：N-亚硝基二甲胺，二甲双胍，甲醇，N-二甲基亚砜

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