5种天然植物提取物中4种多环芳烃的HPLC—FLR测定方法（三）

3、样品前处理方法建立与优化

（1）空白排查

空白试样溶液在4种多环芳烃位置有目标峰出现，是影响检测准确性的关键因素。本文对实验中所用试剂、器具及玻璃器具清洗方式进行了系统排查与验证，结果表明：色谱纯试剂对检测结果影响较小，分析纯试剂对检测结果影响较大，纯净水不对检测结果产生影响；卓越尼龙0.22μm针式过滤器对检测结果影响最小；过滤乙腈时，塑料注射器对检测结果的影响小于玻璃注射器；玻璃器具用色谱纯正己烷、色谱纯甲醇依次分别清洗一遍后可以满足检测需要。

（2）万寿菊提取物前处理方法建立与优化

采用GPC流动相超声提取万寿菊提取物中多环芳烃，样品分散度差，不利于多环芳烃的提取，为使样品在提取过程中处于溶解或分散状态，本文验证了丙酮、二氯甲烷、DMF、50％丙酮二氯甲烷、乙醇作为促溶溶剂时4种多环芳烃的分离效果。结果表明：丙酮作为促溶溶剂时，万寿菊提取物在GPC流动相中分散度良好，4种多环芳烃分离度高。因此选择丙酮作为万寿菊提取物前处理的促溶溶剂。

（3）番茄提取物前处理方法建立与优化

采用GPC流动相超声提取番茄提取物中多环芳烃，样品分散度和4种多环芳烃分离度良好，但加标回收率低于60％。根据番茄提取物性质，在前处理过程中加入二氯甲烷作为促溶溶剂，经验证样品分散度和4种多环芳烃分离度良好，4种多环芳烃加标回收率在65％～100％之间。因此选择二氯甲烷作为番茄提取物前处理的促溶溶剂。

（4）葡萄籽提取物和绿咖啡豆提取物前处理方法建立与优化

参考相关国标和文献，分别验证了正己烷萃取，50％丙酮二氯甲烷萃取，水溶液萃取正己烷反萃取的液液萃取、甲醇水溶液萃取正己烷反萃取的液液萃取和乙醇水溶液萃取正己烷反萃取的液液萃取，不同萃取溶剂和萃取方式下的萃取效果。结果表明，乙醇水溶液萃取正己烷反萃取的液液萃取方式，4种多环芳烃分离度良好，加标回收率在65％～107％之间。因此选择乙醇水溶液萃取正己烷反萃取的液液萃取方式作为葡萄籽提取物和绿咖啡豆提取物的前处理方法。

（5）姜黄提取物前处理方法建立与优化

采用GPC流动相超声提取姜黄提取物中多环芳烃，样品加标回收率低，且污染凝胶渗透色谱柱；采用丙酮超声提取姜黄提取物中多环芳烃，样品完全溶解，杂质多，且加标回收率低；采用丙酮超声提取姜黄提取物中多环芳烃，萃取液经多环芳烃固相萃取柱净化，4种多环芳烃分离度良好，加标回收率在75％～85％之间。因此选择丙酮超声萃取、固相萃取柱净化的方式作为姜黄提取物的前处理方法。

4、准确度验证

分别在万寿菊提取物、番茄提取物、葡萄籽提取物、绿咖啡豆提取物和姜黄提取物样品中添加2、5、10μg／kg  3个水平标准工作溶液，每个添加浓度水平进行6个重复测定。

用万寿菊提取物精确称取0.19万寿菊提取物样品(精确至0.00019)于25mL容量瓶中，用玻璃移液管加入2mL色谱纯丙酮促溶，涡旋使其混合均匀后，加入GPC流动相定容，摇晃混合均匀，超声溶解。使用玻璃注射器，用0.22um滤膜过滤至GPC进样管中，经GPC净化。

收集液使用旋转蒸发仪浓缩至近干，氮气吹干，用2mL 88％乙腈水溶液准确定容，超声溶解，样品液使用一次性注射器过0.22μm滤膜，装小瓶进样检测。

用番茄提取物，精确称取0.2～0.39番茄提取物样品(精确至0.00019)于25mL具塞玻璃试管中，用玻璃移液管加入2mL色谱纯二氯甲烷促溶，涡旋使其混合均匀后，加入GPC流动相定容，摇晃混合均匀，在40℃以上的超声波清洗机中超声提取30min。在3500r／min、5℃条件下离心5min。使用玻璃注射器，用0.22μm滤膜过滤至GPC进样管中，经GPC净化。收集液使用旋转蒸发仪浓缩至尽干，氮气吹干，用2mL 88％乙腈水溶液准确定容，超声溶解，样品液使用一次性注射器过0.22μm滤膜，装小瓶进样检测。

用葡萄籽提取物和绿咖啡豆提取物。精确称取0.3～0.59样品(精确至0.00019)于10mL试管中，依次加入3mL超纯水和0.5mL色谱纯乙醇溶液，涡旋、超声使其溶解，再加入2mL色谱纯正己烷，涡旋混匀。在4000r／min、15℃条件下离心5min。绿咖啡豆提取物用移液枪将上层正己烷转移至圆底烧瓶中，葡萄籽提取物用60℃～80℃水浴加热溶液，使正己烷层溶解，再用移液枪将上层正己烷转移至圆底烧瓶中，用正己烷重复萃取1次，合并正己烷溶液。氮气将正己烷吹干，用2mL88％乙腈水溶液准确定容，超声溶解，样品液使用一次性注射器过0.22μm滤膜，装小瓶进样检测。

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