劲骨胶囊功效成分鉴别及其盐酸氨基葡萄糖含量测定（五）

D₃同样是脂溶性维生素和微囊化产品，在样品中含量更低（0.5～1.0μg/g）。中国药典二部对于D₃化学纯品，用HPLC正相色谱、红外进行鉴别。借鉴Jiao等对于牛奶中痕量维生素D用石墨烯磁性固相萃取柱纯化富集样品，HPLC法分离测定及GB5009.82-2016维生素D₃的HPLC测定的方法进行优化改进。样品用稀氨水超声打破囊壁和无水乙醇溶解，再用正己烷提取后正相色谱分离鉴别。省去了石墨烯固相萃取柱纯化样品及国标法中皂化、石油醚提取、洗涤及真空干燥等繁琐步骤。方法的检测限为7ng/g，符合鉴别要求。经分析，上述2种HPLC法亦能有效地证明样品中真实存在维生素K₁和D₃。

6、盐酸氨基葡萄糖的含量测定方法

（1）色谱分离图

在鉴别劲骨胶囊配方中所有的功效成分后，精密称取胶囊内容物20mg，于三角瓶中，先加1mL乙腈使样品湿润分散，再加适量水超声提取5min，取出，放至室温，转移至25mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，作为样品溶液；精密称取盐酸氨基葡萄糖对照品10mg，于25mL容量瓶中，先加1mL乙腈湿润分散，用水定容至刻度，摇匀，制成400μg/mL对照品溶液的方法对其最主要的功效成分盐酸氨基葡萄糖进行了含量测定。结果显示，对照品及样品色谱峰均达到基线分离，主峰只有1个，保留时间一致，峰形狭窄对称，无杂峰干扰，符合定量要求，如图9所示。同时此方法动相用乙腈-0.4%（mL/mL）磷酸（三乙胺调至pH3.0）（4:96，V:V）替代乙腈-离子对试剂，可提高色谱柱的使用寿命，减少管道堵塞，使测定更加简便快捷。

（2）方法学验证

①线性回归方程、相关系数、线性范围、方法检测限及定量限

盐酸氨基葡萄糖在96～1200μg/mL范围内呈线性关系，线性方程为Y=778.82X+6774.80，相关系数r2=0.9999，按样品最低浓度测出的信噪比3:1确定方法的检测限为1.2μg/mL，按信噪比10:1确定方法的定量限为3.8μg/mL。

呈直线回归，相关性好，线性范围宽，方法检测限和定量限低。

②样品测定方法精密度实验

选定样品某一最适浓度，重复测定6次，相对标准偏差为0.72%，说明本方法重现性好，精密度高。

③样品回收率实验

在线性范围内采用加标回收的方法进行测定。选定已知浓度样品作为本底，以其浓度为1，按低、中、高，即0.5:1、1:1、1.5:1左右浓度的对照品加入本底中，每个浓度重复3次，共9个样品。通过供试品中含量值、对照品加入量和测定值计算回收率和RSD。经测定计算，结果见表1，低浓度平均回收率为99.78%，RSD为0.22%；中浓度平均回收率为100.40%，RSD为0.17%；高浓度平均回收率为100.01%，RSD为0.49%，具有较高的准确性。
 

7、样品中盐酸氨基葡萄糖含量的测定

在方法学验证基础上，对连续3批劲骨胶囊中盐酸氨基葡萄糖的含量进行定量测定，产品各批含量基本一致，RSD为0.48%，如表2所示。说明产品质量稳定，测定结果重复性好、灵敏度和精确度较高。

四、结论与讨论

本研究建立了对劲骨胶囊功效成分的鉴别方法，在盐酸氨基葡萄糖的薄层色谱鉴别中，增加了样品用石油醚脱脂纯化步骤，并在展开剂中加入茚三酮显色剂，使展开和显色同时进行，取得较好的效果。在白芍提取物的鉴别中，增加了样品用正丁醇纯化样品步骤，使样品能很好分离芍药苷，同时在薄层中设计了对照提取物、对照药材、对照品多个参照物，比药典仅用1个参照物鉴别效果更具说服力和可信度。在维生素K₁和D₃的HPLC法鉴别中，样品微囊破壁和提取同步进行，比国家标准和相关文献有较大改进，简化了很多繁琐操作步骤，节省时间，节约试剂，提高鉴别效果。同时本文对HPLC法测定盐酸氨基葡萄糖含量进行了优化，选择通用的C18反相柱和紫外检测器，采用简便的提取方法，优化流动相的组成、比例和pH值，提高了测定精密度和准确度。上述鉴别和含量测定方法专属性强、重现性好、灵敏度高，可管控产品质量。

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