陈皮抗油脂氧化活性成分研究（二）

②对亚油酸过氧化的抑制作用

洗脱物1～6用无水乙醇溶解，首先确定各洗脱物的饱和浓度，为了便于比较，将六种洗脱物统一配制成较小饱和浓度值的贮备液，为4.05mg／mL。以维生素C做阳性对照，清除DPPH活性测定提取物1、2和3用无水乙醇溶解，提取物4用蒸馏水溶解，首先确定各提取物的饱和浓度，为了便于比较，将四种提取物统一配制成较小饱和浓度值的储备液，再用二倍稀释法稀释，选择合适的测试浓度范围，最终四个待测提取物溶液浓度取值分别为0．14、0.27、0.54、1.08和2.15mg／mL。以抗坏血酸(维生素C)为对照，清除DPPH活性测定方法：取1.0mL各待测溶液，加入3.0mL的409g／mL DPPH乙醇溶液混合，室温避光反应30min后于517nm下测定吸光值，计算其清除率，清除率(％)=(A₀一As)／A₀×100％，其中A₀为空白组吸光度，As为样品组吸光度值。先测定各样品在浓度为4.05mg／mL时对DPPH的清除作用，确定活性较好的样品，再测定其在不同时间对亚油酸过氧化的抑制作用，具体方法参考文献进行：将1.0mL不同样品溶液中加入3mL的2.5％亚油酸一无水乙醇溶液，混匀后置于40℃培养箱。每隔1d(共5d)，取出0.5mL待测样品，加入lmL 25％TCA混匀，静置20min后加入lmL 0.67％TBA，沸水浴加热10min。冷却后加入4mL正丁醇，摇匀，4000r／min室温离心10min，取上层液于532nm处比色，同时测定不加抗氧化物的空白管吸光度，计算抑制率。抑制率(％)=(A₀—As)／～×100％，其中～为空白组吸光度、As为样品组吸光度值。

③对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制作用

化合物1～6用无水乙醇溶解，首先确定各化合物的饱和浓度，为了便于比较，将六个化合物统一配制成较小饱和浓度值的贮备液，为4.02mg／mL。以维生素C做阳性对照，洗脱物1～6用无水乙醇溶解，首先确定各洗脱物的饱和浓度，为了便于比较，将六种洗脱物统一配制成较小饱和浓度值的贮备液，为4.05mg／mL。以维生素C做阳性对照，清除DPPH活性测定提取物1、2和3用无水乙醇溶解，提取物4用蒸馏水溶解，首先确定各提取物的饱和浓度，为了便于比较，将四种提取物统一配制成较小饱和浓度值的储备液，再用二倍稀释法稀释，选择合适的测试浓度范围，最终四个待测提取物溶液浓度取值分别为0.14、0.27、0.54、1.08和2.15mg／mL。以抗坏血酸(维生素C)为对照，清除DPPH活性测定方法：取1.0mL各待测溶液，加入3.0mL的4099／mL DPPH乙醇溶液混合，室温避光反应30min后于517nm下测定吸光值，计算其清除率，清除率(％)=(A₀一As)／A₀×100％，其中A₀为空白组吸光度，As为样品组吸光度值。先测定各样品在浓度为4.05mg／mL时对DPPH的清除作用，确定活性较好的样品，再测定其在不同时间对亚油酸过氧化的抑制作用，具体方法参考文献进行：将1.0mL不同样品溶液中加入3mL的2.5％亚油酸一无水乙醇溶液，混匀后置于40℃培养箱。每隔1d(共5d)，取出0.5mL待测样品，加入lmL 25％TCA混匀，静置20min后加入lmL 0.67％TBA，沸水浴加热10min。冷却后加入4mL正丁醇，摇匀，4000r／min室温离心10min，取上层液于532nm处比色，同时测定不加抗氧化物的空白管吸光度，计算抑制率。抑制率(％)=(A₀—As)／～×100％，其中～为空白组吸光度、As为样品组吸光度值。先测定各化合物溶液在相同时间对亚油酸过氧化的抑制作用，确定活性较好的样品，再测定其在不同时间下对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制作用，脂质体过氧化物采用紫外吸收测定法测定，方法参考文献改进：取新鲜鸡蛋卵黄适量，加入等体积95％乙醇于37℃磁力搅拌10min，抽滤，滤液再用95％乙醇稀释定容，使浓度达到0.8％。取该溶液0.2mL，分别加入不同浓度待测样品溶液各lmL，空白加入等体积的无水乙醇，再各加入0.005mol／L的硫酸铜201aL，放入水浴恒温震荡器中震荡，速度为100次／min，温度为37℃。每24h取0.1mL氧化液加入5mL乙醇，混匀后，以乙醇为空白，用1cm石英比色皿在234nm处测定吸光度值，计算抑制率。抑制率(％)=(Ao—As)／～×100％，其中Ao为空白组吸光度、As为样品组吸光度值。

④对油脂氧化的抑制作用

配制单体化合物的饱和浓度，再用二倍稀释法稀释，确定最适宜浓度范围，依次测定其在不同浓度下对DPPH的抑制作用,清除DPPH活性测定提取物1、2和3用无水乙醇溶解，提取物4用蒸馏水溶解，首先确定各提取物的饱和浓度，为了便于比较，将四种提取物统一配制成较小饱和浓度值的储备液，再用二倍稀释法稀释，选择合适的测试浓度范围，最终四个待测提取物溶液浓度取值分别为0.14、0.27、0.54、1.08和2.15mg／mL。以抗坏血酸(维生素C)为对照，清除DPPH活性测定方法进行：取1.0mL各待测溶液，加入3.0mL的40μg／mL DPPH乙醇溶液混合，室温避光反应30min后于517nm下测定吸光值，计算其清除率，清除率(％)=(A₀一As)／A₀× 100％，其中A₀为空白组吸光度，As为样品组吸光度值,对亚油酸过氧化的抑制作用洗脱物1～6用无水乙醇溶解，首先确定各洗脱物的饱和浓度，为了便于比较，将六种洗脱物统一配制成较小饱和浓度值的贮备液，为4.05mg／mL。以维生素C做阳性对照，先测定各样品在浓度为4.05mg／mL时对DPPH的清除作用，确定活性较好的样品，再测定其在不同时间对亚油酸过氧化的抑制作用，将1.0mL不同样品溶液中加入3mL的2.5％亚油酸一无水乙醇溶液，混匀后置于40℃培养箱。每隔1d(共5d)，取出0.5mL待测样品，加入lmL 25％TCA混匀，静置20min后加入lmL 0.67％TBA，沸水浴加热10min。冷却后加入4mL正丁醇，摇匀，4000r／min室温离心10min，取上层液于532nm处比色，同时测定不加抗氧化物的空白管吸光度，计算抑制率。抑制率(％)=(Ao—As)／～×100％，其中～为空白组吸光度、As为样品组吸光度值。对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制作用化合物1～6用无水乙醇溶解，首先确定各化合物的饱和浓度，为了便于比较，将六个化合物统一配制成较小饱和浓度值的贮备液，为4.02mg／mL。以维生素C做阳性对照，先测定各化合物溶液在相同时间对亚油酸过氧化的抑制作用，确定活性较好的样品，再测定其在不同时间下对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制作用，脂质体过氧化物采用紫外吸收测定法测定，取新鲜鸡蛋卵黄适量，加入等体积95％乙醇于37℃磁力搅拌10min，抽滤，滤液再用95％乙醇稀释定容，使浓度达到0.8％。取该溶液0.2mL，分别加入不同浓度待测样品溶液各lmL，空白加入等体积的无水乙醇，再各加入0.005mol／L的硫酸铜20mL，放入水浴恒温震荡器中震荡，速度为100次／min，温度为37℃。每24h取0.1mL氧化液加入5mL乙醇，混匀后，以乙醇为空白，用1cm石英比色皿在234nm处测定吸光度值，计算抑制率。抑制率(％)=(Ao—As)／～×100％，其中Ao为空白组吸光度、As为样品组吸光度值。及对大豆油氧化的抑制作用。对大豆油氧化抑制作用，称取10mL大豆油，加入lmL样 品溶液，于48℃水浴恒温22h，取样lmL加入 2mL 0.67％TBA溶液，2mL 20％TCA，沸水浴 20min，冷却至37℃，加入5mL CHCl₃溶液，摇 匀，3500r/min离心10min，取上清液于532nm处 测吸光度，空白用溶剂代替样品溶液，并以维生 素C做阳性对照，计算抑制率。抑制率(％)= (A₀一As)/～×100％，其中Ao为空白组吸光度、 As为样品组吸光度值。 

(3)单体化合物的鉴定

测定抗氧化活性较好的单体化合物的红外光谱(IR)、核磁共振氢谱(1H—NMR)、核磁共振碳谱(13C-NMR)和质谱(MS)并进行分析，鉴定该化合物结构。

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