有机固体废弃物生物转化技术研究进展（二）

2.2　反硝化作用

参与氮循环反硝化作用的功能基因包括了硝酸盐还原酶（narG）、亚硝酸盐还原酶（nirK/nirS）、一氧化氮还原酶（norB）、氧化亚氮还原酶（nosZ）等，分别负责催化NO₃-—NO₂-—NO—N₂O—N₂转化。其中，nirK/nirS、nosZ是最常用于开展反硝化研究的主要分子标记基因。通过PCRDGGE技术和荧光定量PCR技术的分析，堆肥中各个时期普遍存在nirK/nirS、nosZ，而研究nirK/nirS在堆肥中反硝化作用的相对贡献率，既是影响温室气体N₂O排放的重要因素，也是理解堆肥中氮素转化机制的关键问题。有研究者在堆肥中添加生物炭，发现nirK基因丰度受到抑制，并且N₂O的排放显著减少。新近研究结果则更加明确了nirK/nirS的相对贡献率，通过采用选择性抑制剂以及同位素比率法测定了牛粪堆肥中细菌nirK/nirS、真菌nirK的反硝化活性，从而明确了在牛粪堆肥过程中，细菌nirK的反硝化活性是N₂O排放的关键功能酶，但参与编码nirK的反硝化细菌种类繁多，仍然需要进一步开展相关研究。而也有研究表明不同堆肥阶段的narG，nirS和nosZ的基因表达与N₂排放显著相关。因此，不同堆肥条件下，阐明参与反硝化作用的功能微生物群落结构及其如何影响N₂O排放，与堆肥环境因子的作用机制等仍是有待的深入探索。

2.3　厌氧氨氧化作用

厌氧氨氧化（AnaerobicAmmoniumOxidation,Anammox）则是继硝化、反硝化后被发现的由微生物介导的氮素转化过程，由于厌氧氨氧化过程与反硝化过程对NO₂的竞争作用会引起N₂O、N₂ 排放的差异，最终将影响堆肥过程的温室气体N₂O的排放。厌氧氨氧化细菌普遍存在于自然环境中，主要是在高氮、缺氧或好氧/缺氧的交界面环境条件中生存，在许多生态系统中是主要的氮损失途径，不同生态系统中具有不同优势类群的厌氧氨氧化细菌，在堆肥体系中的研究则刚刚起步。

2.3.1厌氧氨氧化的关键酶基因分子标记研究　

参与Anammox过程的微生物组成、关键酶基因、生态分布等基因组学信息被科学家逐步认知，这主要依赖于分子标记手段进行研究。由于厌氧氨氧化细菌16SrRNA基因序列存在特异性不足的问题，研究者对参与Anammox过程关键功能酶及其编码基因进行深入研究，这包括亚硝酸盐还原酶（Nir），联氨合成酶（HZS）和联氨氧化酶（HZO）及其编码基因（包括了nirS、nirK、hzs、hzo基因）可更好地应用于多样性研究中。但不同功能基因在用于评估厌氧氨氧化细菌的多样性和群落结构的研究中实际效果仍有不同。采用这些功能基因的研究仍处于初步的阶段，研究发现nirS基因并非存在于所有厌氧氨氧化细菌，部分厌氧氨氧化细菌只检测到了nirK基因。现有的研究结果显示，nirS不适于单独作为厌氧氨氧化细菌群落分析的特异性分子标记，而应用hzsA、hzsB、hzo基因获得的分析结果与16SrRNA基因的研究结果具有较好的一致性，且hzs、hzo基因具有更高特异性。

2.3.2不同生境的厌氧氨氧化菌群结构及其环境影响因子　

目前，对厌氧氨氧化过程的研究主要集中在不同类型生境的细菌群落演化，包括海洋、淡水、陆地生态系统等。研究发现，CandidatusScalindua属通常在海洋生态系统的高盐度环境中占据绝对优势，河口生态系统中以Ca.Scalindua、Ca.Brocadia、Ca.Kuenenia为主，污水厂、反应器等工程生态系统中以Ca.Brocadia、Ca.Kuenenia和Ca.Jettenia为主，农田土壤中则以Ca.Brocadia、Ca.Kuenenia为主。盐分、氮素养分、温度、溶解氧等均是影响厌氧氨氧化细菌群落结构的重要环境因子。Ca.Scalindua适应高盐度的海洋环境主要是通过表达一种对NO^-₂、NH⁺₄具有高亲和力的蛋白质。而Ca.Brocadia通常生长于淡
水生态环境且倾向于在高浓度的NO^-₂、NH⁺₄环境中占据优势。针对海洋生态系统的研究发现，NH⁺₄、NH⁺₄/∑（NO^-₃+NO^-₂）与厌氧氨氧化细菌多样性正相关，而有机质含量则是负相关。

另外，厌氧氨氧化细菌可以在宽泛的温度中生存，从高寒环境到深海热液，群落结构也会随着温度变化而发生演化。Ca.Kuenenia对温度变化具有很好的适应性，而Ca.Scalindua则能够在80℃的环境中生存。

2.3.3好氧堆肥中厌氧氨氧化菌群研究　

在好氧堆肥过程中，由于存在着微环境局部厌氧条件，已有研究发现在牛粪堆肥过程中的检测出厌氧氨氧化细菌，并研究了厌氧氨氧化细菌群落多样性。研究者采用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术对厌氧氨氧化细菌16SrRNA基因扩进行增，分析了牛粪堆肥过程中厌氧氨氧化细菌多样性，结果显示厌氧氨氧化细菌存在于整个堆肥过程，Ca.Brocadia、Ca.Kuenenia和Ca.Scalindua3个属为优势菌属，且多样性随着不同堆肥阶段变化，高温期和降温期的多样性较高；与其他生态系统的研究结果不同的是，在堆肥高温期的优势菌属是Ca.Brocadia。而针对不同堆肥原料的好堆肥过程中，厌氧氨氧化细菌多样性是否具有一致性，群落结构组成对堆肥环境条件异质性的响应，以及环境因子驱动厌氧氨氧化的作用机制等内容仍有待于进一步的开展。

3　好氧堆肥过程的硫素转化

在硫素代谢方面，堆肥中恶臭硫气体的排放，尽管排放通量较低，但其嗅阈值远远低于NH₃，成为限制堆肥技术发展的主要次生环境污染问题。硫素生物转化过程（图1）中，如硫化氢在好氧条件下可被硫氧化细菌氧化形成硫酸盐，而在厌氧条件下硫酸盐则被还原为H2S等恶臭硫气硫氧化途径，包括：（1）硫化物氧化途径，黄素细胞色素c硫化氢脱氢酶（Fcc）、硫化物醌还原酶（Sqr）；（2）单质硫氧化途径，异化亚硫酸盐还原酶（Dsr）、类异二硫醚还原酶（Hdr）；（3）硫氧化酶复合体（Sox）等。Luo等对硫氧化酶系统（soxB）、硫化物醌还原酶（sqr）、异化亚硫酸还原酶（dsrA）编码基因的高通量测序分析，揭示了珠江流域中的硫氧化优势种群以及功能基因的多样性，表明硫氧化细菌在水体硫生物化学循环
发挥着重要作用。在硫氧化细菌中，硝酸盐还原硫氧化细菌（Nitrate-reducing,sulfide-oxidizingbacteria,NR-SOB）是一类将硝酸盐还原与硫化物氧化同时催化进行的细菌，NR-SOB的多样性和分布特征是研究碳氮硫循环的重要菌群，可指导污水、黑臭水体、污泥治理等诸多氮硫转化调控技术。

在好氧堆肥中的硫素转化研究，主要集中在通过添加外源化合物、功能微生物调控堆肥过程，从而实现减少氮素损失和恶臭气体排放。通过添加硫磺可以改善堆肥品质，减少氮素损失。最初，在堆肥中添加具备酸性化学特性的单质元素硫，有效降低了堆肥pH，更有利于堆肥产物的农田应用。进一步研究发现，在堆肥中添加硫磺和硫氧化细菌既降低堆肥pH，且显著提高了堆肥中NH₄⁺、NO₃^-含量。由此可推测，堆肥中存在着氮硫相互作用，添加硫磺和硫氧化细菌不仅影响了堆肥pH，也影响了氮素转化。利用硝酸盐作为电子受体，对硫酸盐还原起到竞争性抑制作用，在堆肥中添加硝酸盐显著降低恶臭硫气体的产生。近年来，有学者通过添加外源七钼酸铵和亚硝酸盐到好氧堆肥中，有效降低恶臭硫气体（二甲基硫、二甲基二硫）的排放量达92.3%和82.3%。目前，在好氧堆肥中的硫素转化研究中，针对参与好氧堆肥过程中的硫素转化的微生物多样性以及群落结构等研究较少，对参与堆肥恶臭硫气体转化的功能微生物及其动态变化过程也知之甚少，仍有待于进一步开展相关研究工作，以阐明其相关的作用机理。

4　展望

长期以来，畜禽粪污综合利用率低、好氧堆肥处理效率低，其核心问题即是由微生物驱动氮、硫物质转化过程所引起的氮素流失及臭气排放。得益于高通量测序等现代分子生物学技术，科学家可以深入的研究参与好氧堆肥过程的微生物群落特征以及功能微生物的分子机制。然而人们通常只针对某一类微生物、氮素或硫素单一的转化过程开展独立研究，如针对好氧堆肥工艺调控过程中的氮循环硝化、反硝化的功能微生物上的研究等。在现有的研究中，好氧堆肥微生物群落的动态变化及其时空异质性已取得初步的了解，这有助于我们增加对不同堆肥阶段发挥主要作用的优势菌群的认知。同时，已有研究分析了厌氧氨氧化对局部生态系统中氮循环的贡献率，但对于好氧堆肥中的厌氧氨氧化过程则知之甚少，仅有的研究证实了堆肥过程中存在厌氧氨氧化作用。在硫素转化过程的研究中，也已证实了氮硫转化的关联性，但对堆肥过程中的氮硫相互作用机理则少有深入的研究，针对氮硫作用的研究主要集中在污水、黑臭水体、污泥治理等领域。

因此，在现有研究的基础上，从不同堆肥物料的氮硫生物转化过程出发，利用基因组学与理化分析相结合的技术手段，对畜禽粪污好氧堆肥工艺下的氮硫转化动态、气体排放规律、生物化学机理等进行深入研究，阐明相关功能微生物的群落特征及功能基因表达情况，既可以从微生物尺度提升对堆肥过程中物质转化规律的认识，也有利于揭示整个堆肥过程中影响氮硫生物转化的环境因子（图1）。此外，可同时利用多组学、同位素标记技术等验证各个氮硫生物转化过程之间的耦合作用及相关功能微生物种群在物质循环中的贡献率，为提升畜禽粪污高效生物转化技术工艺、恶臭气体减排提供坚实的科学基础。

当前我国正处于农业转型升级的关键时期，积极推进农业绿色发展，减少农药、化肥使用量，促进农膜、秸秆、畜禽粪污等有机废弃物资源循环再利用，是保护农业生态环境和生态文明建设的重要手段。据联合国粮食及农业组织（FAO）的统计数据显示，与2018年相比，到2030年我国畜禽粪污氮素排放总量将达到837万t，增长44.7%。畜禽粪污既是污染物，也是宝贵的养分资源，针对畜禽粪污与日俱增的环境污染压力，加强畜禽粪污生物转化技术的研究与应用，促进好氧堆肥技术发展，使物质和能量得到高效的循环利用，减少废弃物排放与化肥投入，有利于我国生态循环农业、农业现代化和可持续发展。

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