马铃薯块茎和土壤样品中粉痂病菌快速 检测方法的建立（一）

马铃薯粉痂病（Potato powdery scab）是由粉痂菌（Spongospora subterranea f. sp. subterrane）引起的真菌性病害，主要危害根部和块茎，也可使茎染病。粉痂菌以休眠孢子囊球随种薯或病残体越冬。病薯和土壤中病残体为病害的初侵染源，远距离传播主要依靠种薯，田间传播主要通过浇水、病土、病肥等。马铃薯粉痂病能使马铃薯产量减少10%～20%，重者可达到 50%。

我国内蒙古、广东、贵州、江西、浙江、云南、吉林、甘肃、福建等地均有马铃薯粉痂病的发生，国外许多国家和地区，如以色列、美国、巴基斯坦、哥斯达黎加、韩国、意大利等均有报道。由于粉痂菌不能人工培养，国内对马铃薯粉痂菌检测的研究较少，其防治药剂效果也较差，因此，针对马铃薯粉痂菌，亟需建立快速、灵敏、准确性高的检测方法，为该病害的早期监测和预防提供重
要依据。

已报道的土壤带菌量的检测方法有诱饵法、ELISA 法和 PCR 检测。Hui 等以番茄幼苗作为诱饵，检测到马铃薯重茬 0～10 cm 土壤中的马铃薯粉痂病菌。但是番茄幼苗诱饵法只能检测到土壤中粉痂病菌活的游动孢子，无法检测到休眠孢子且检测时间较长、操作繁琐。Liu 等利用棉花黄萎病的病原菌菌丝蛋白作为抗原，制备该病原菌菌丝蛋白的多克隆抗体，建立特异性检测棉花黄萎病菌的间接 ELISA 方法，但由于真菌结构与物质组成复杂,寻找特异性抗原有很大难度；近年来，由于 PCR 技术更加快速、准确、便捷而被广泛应用于病原菌的检测和定量研究。Guo 等[21]通过筛选不同疮痂菌的通用探针，建立了马铃薯疮痂菌的快速 PCR 检测方法，实现了对病组织和土壤样品的快速检测；Nian 等通过建立实时荧光定量 PCR 体系从而快速准确鉴定了小麦黑穗菌（Tilletia controversa Kühn），应用于小麦矮腥黑穗病的早期诊断。

Graff 等根据马铃薯粉痂菌内部转录间隔区设计了一对大小为 61 bp 的特异性引物 SsTQF1/SsTQR1 和一个荧光 Taqman®探针 SsTQP1，可以检测和定量悬浮在水中或与粘土混合的休眠孢子堆。Qu 等[24]根据马铃薯粉痂菌内部转录设计了大小为 434 bp SSF/SSR 引物，该研究成功地应用于有无粉痂病症状的带菌马铃薯块茎的检测，可以检测到1/g土的孢子球。鉴于目前缺乏对马铃薯粉痂菌快速、准确的检测方法，本研究基于马铃薯粉痂菌内部转录间隔区和线粒体 DNA，分别设计了适用于初步检测的普通PCR 特异性引物和实时荧光定量 PCR 特异性引物，建立了快速、高灵敏性的检测体系。针对在生产中马铃薯粉痂病危害严重，缺乏病原菌快速检测的方法的情况。本研究通过筛选特异性好、稳定性高的粉痂菌特异性引物，建立马铃薯粉痂病快速检测体系，以期为马铃薯粉痂病的早期预警提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

试验所用的粉痂菌（S. subterranea）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、葫芦科刺盘孢菌（Colletotrichum lagenarium）、尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、茄匍柄霉菌（Stemphylium solani）、疫霉菌（Phytophthora infestans）、多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）、细极链格孢菌（Alternaria tenuissima）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、疮痂链霉菌（Streptomyces scabies）均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所分离保存（表 1）。

1.2 DNA 提取

马铃薯粉痂病斑或培养基平板上培养一周的菌丝体，采用植物基因组 DNA 提取试剂盒提取植物基因组或病原菌基因组 DNA。混有休眠孢子囊的菌土和田间土壤总 DNA 提取采用 TIANamp Soil DNA Kit 土壤基因组 DNA 提取试剂盒提取土壤总 DNA。NanoDrop 2000定量 DNA 浓度，保存于-20℃备用。

1.3 引物设计

根据 NCBI GenBank 中已登记的马铃薯粉痂菌及其他非靶标菌的标准菌株基因序列（表2），利用DNAMAN 8.0 软件比对，选取粉痂菌内部转录间隔区和线粒体 DNA 的保守区域，设计了两对应用于普通 PCR 的特异性引物 A5: 5'-ACAACTCTTAACAGTGG-3'，A9: 5'-AATGGTTAGAGACGAATC-3'，C3: 5'-AATCTAGAGCACCCCGTTTTCATTCG-3'，C8: 5'-TGCGCAAACCTTAATACGGGAA-3'，扩增产物大小分别为 281 和 391bp；和一对实时荧光定量 PCR 的特异性引物 QF: 5'-GCAACTAAATAAAATTTAATGCTAAAAGTG-3'，QR:5'-TTTGTACGCTAAGTTCGATAGGAG-3'，扩增产物大小为 104 bp（图 1）。引物均由北京博迈德基因公司合成。

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