常压激光离子源辅助基质的研究进展及其在食品领域的应用（一）

基于激光的电离质谱具有空间分辨率高、样品预处理简单、易于便携化和可实现成像分析等特点。基质辅助的激光离子源质谱可以避免高能量对分子结构的破坏，在生物大分子分析和检测方面获得了广泛应用。传统辅助基质在低分子量范围的干扰较强，极大地限制了常压基质辅助激光离子源的应用，为解决这一问题，一系列基于新型材料的辅助基质被设计和开发出来。这些新型材料可分为两大类：新型有机基质和无机材料。质量范围的扩展和目标化合物灵敏度的增强，显著扩展了常压基质辅助激光离子化技术在原位分析中的应用。该文针对新型辅助基质在常压激光离子源及其在食品安全领域的应用进行了综述，并展望了未来的研究趋势。

近年来，基于激光的敞开式离子源凭借其高效、原位、高空间分辨率和易于成像等优势，被广泛应用于医学检验、食品安全等领域，如常压基质辅助激光解吸电离技术(Atmospheric pressure matrix assisted laser desorption/ionization，AP-MALDI)、电喷雾辅助激光解吸电离技术(Electrospray-assisted laser desorption/ionization，ELDI)、基质辅助激光解吸电喷雾电离技术(Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization，MALDESI)、激光烧蚀电喷雾电离技术(Laser-ablation electrospray ionization，LAESI)、激光辅助解吸电喷雾电离技术(Laser-assisted desorption electrospray ionization，LADESI)、激光解吸电喷雾电离源(Laser-desorption electrospray ionization，LDESI)、激光烧蚀大气压光电离技术(Laser-ablation atmospheric-pressure photoionization，LAAPPI)、激光解吸常压化学电离源(Laser-desorption atmospheric-pressure chemical ionization，LD-APCI)等。基于激光的电离技术虽然极大地促进了质谱分析向实时、原位检测技术的发展，但解离过程中存在分子结构破坏严重、激光能量转化效率低等问题，常需要添加辅助基质以提高对激光能量的吸收，改善特定波长激光的能量转化效率。

AP-MALDI是一种在大气压条件下工作的软电离技术，也是最常用的敞开式激光电离源，对于较难离子化的大分子物质(102～106 Da)，特别是蛋白质类的生物大分子，具有一定的离子化效果。AP-MALDI技术具有分析速度快、灵敏度高、实时原位检测等特点，与另一种软电离方法电喷雾离子源(ESI)相比，AP-MALDI对样品的前处理要求更宽松，且更易得到单电荷离子峰。基于以上优点，AP-MALDI在医学、药学、食品等行业得到了广泛应用。最近的研究表明，AP-MALDI可与便携质谱(Portable mass spectrometry)相结合，极大地提高现场分析能力。

AP-MALDI的工作原理是使用激光照射待测物质与基质形成的共结晶薄膜时，基质从激光中吸收能量传递给待测分子，而电离过程中涉及到待测物质电荷转移和由固态至气态的相转变过程，最后待测物以气态离子的形式进入质量分析器(见图1)。此外，基质的加入还可起到分散分析物的作用，防止分析物之间发生相互作用或产生类似于二聚体的信号。在此过程中，基质及其添加剂的性质(如酸碱度、分子量，是否具有发色团)、基质的使用方法等会直接影响共结晶的厚度和均匀程度，进而对电离的整体效果和分析结果的准确性、灵敏性和重复性造成巨大影响[8]。因此，选择合适的基质或基质添加剂对于AP-MADLI的电离效果至关重要。

 图1 基质辅助激光解吸电离的离子源原理及新型基质研发策略
 

Fig.1 Mechanism of matrix assisted laser desorption/ionization and development strategy of new matrix

1 AP-MALDI辅助基质的研究进展

根据基质的作用和既往研究，总结出辅助基质的几个基本特点。首先，基质和待测样品应具有较好的互溶性，或可溶于同一类溶剂中，使得基质材料存在于溶剂蒸发后与分析物形成的共结晶中，此时可认为基质材料是待测物的固体溶剂。其次，基质必须具有较强的特征波长吸收性质。AP-MALDI中的待测物需要由基质进行激光能量的吸收和转移来实现软电离，以避免样品分子在激光中不必要的断裂。除此之外，合格的基质还应具有反应惰性，既不与待测物质发生反应改变其结构和含量，又需有一定的吸附和解吸附能力。值得注意的是，挥发性的基质一般需提前进行排除，以减少基质对检测结果的干扰。除了考虑以上特性外，基质的选择还需要结合待测物的分子质量范围和理化性质进行评估。然而，现有基质常具有局限性，例如基质与样品分子共结晶不均匀，基质与样品间能量转移效果差，基质自身的电离峰干扰样品检测，这些问题阻碍着AP-MALDI的进一步应用。开发稳定不易电离，能够与样品形成均匀而分散良好的共结晶的基质是推动AP-MALDI进展的首要任务。

1.1 传统基质概述

自激光离子源(LDI)问世以来，最重要的突破莫过于使用基质作为化学反应的媒介。传统的基质几乎均为有机基质，具有芳香环结构，在245～355 nm波长范围内具有明显的紫外吸收，且分子量主要集中于200 Da左右，例如α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、4-羟基-3，5-二甲氧基肉桂酸(SA)、9-氨基吖啶(9-AA)、2，4，6-三羟基苯乙酮(THAP)和2，5-二羟基苯甲酸(DHB)等。在这类基质中，可离子化的羧基、羟基是检测多肽、蛋白质等极性物质的基质中常见的官能团，均能表现出一定的质子亲和力，可与分析物之间形成质子交换。然而，传统基质在检测样品时易出现部分区域内的信号强度明显增大(称之为“热点”)，而其他区域信号强度降低的现象。“热点”出现的不均匀性、随机性和难避免性导致每次检测的信号强度会出现明显差异，这对样品的检测重现性有着不利影响。此外，基质自身电离产生的碎片离子峰会掩盖、抑制或增强样品的峰信号，干扰后续的质谱分析。为此，对现有基质进行加工修饰或开发新基质等改善措施是刻不容缓的。

1.2 有机基质的研究进展

目前有机基质的使用最为广泛，且适合多种目标物的分析，其中，尼克酸是最早应用于MALDI中的有机基质。随着人们对有机基质不断深入的研究和发展，更多的有机基质因其在MALDI中良好的适用性而被发掘，如CHCA、9-AA、DHB等。虽然这些有机小分子在基质辅助激光离子源中具有一定的通用性和稳定性，但随着检测目标的扩大和检测要求的增加，传统基质的局限性限制了其进一步应用。最初，由于小分子物质的化学可塑性，人们着力于传统基质的优化，这在一定程度上提高了对某些特定对象的分析表现，但其局限性未得到有效改善。而对传统基质进行修饰，或采用添加剂、混合基质等方法，是目前比较主流的改善基质辅助激光离子化效率的方法。

1.2.1 针对传统基质的修饰

Fukuyama团队通过对传统DHB基质进行长链烷基化修饰，得到新基质烷基化二羟基苯甲酸(ADHB)。由于疏水烷基链的引入，基质和疏水性多肽的结合能力大大增强，从而改善了该疏水性物质的检测效果。将ADHB与传统基质CHCA进行比较，发现ADHB对疏水性肽链的结合效果显著增强，检测灵敏度提高了10～100倍，但“热点”不均匀现象并未得到很好地改善，且ADHB因单独作为基质缺乏离子化能力而只能被用作添加剂。该团队进行了进一步探索：引入烷烃链对传统基质THAP进行功能化修饰，产生新基质烷基化三羟基苯乙酮(ATHAP)。与传统基质CHCA相比，该新基质规避了“热点”的产生，检出限降低了1个数量级。除了功能化修饰外，新原子的引入对于基质的质子亲和力也具有很大影响。Jaskolla团队以CHCA的结构为基础引入了氯，产生的新基质Cl-CHCA相对于传统CHCA表现出更强的多肽亲和力以及检测灵敏度，同时重现性也得到改善。膜蛋白对于生物系统至关重要，但其特殊的性质使分析和检测成为难题，尤其是疏水性膜蛋白。Wang等对CHCA的羧基烷基链进行酯化修饰，并合成了一系列衍生物，其中CHCA-C3对完整蛋白分子表现出极高的检测灵敏度。这主要归功于该新基质的高激光消融能力以及分子间疏水亲和力的提升。总体来说，针对某种特定目的进行传统基质的修饰是一种简单、可行、有效的方法。

1.2.2 基于传统基质的混合基质

以传统基质的理化性质为基础，结合不同添加剂或不同性质的基质进行总体基质的改变，是近年来研究人员探索的一种较简易的方法。Abdelhamid等将糠酸和甲芬那酸混合生成新基质，用于检测谷胱甘肽、三磷酸腺苷、磺胺噻唑等混合物。新基质可有效吸收激光能量并进行能量转移，减少了离子碎片峰的数量，并显著提高离子化效率。将新基质与传统基质DHB进行对比发现，新基质在真空条件下呈现出更高的稳定性，推测是由于混合基质中的甲芬那酸具有高于DHB基质1.2倍的升华能力。Lu等以喹诺酮类物质为基质添加剂，检测血液中的痕量喹那普利。研究发现含氮化合物可以抑制血液中共存物对喹那普利分析的干扰，而传统基质CHCA即使经过优化、修饰也不能很好解决这一难题。同时比较了氧氟沙星、双氟沙星等喹诺酮类物质作为基质添加剂的效果，证实使用该类物质作为基质添加剂对血液中痕量喹那普利的识别和定量具有很好的效果。

1.2.3 离子液体基质

由于传统基质中“热点”不均匀问题的不可避免，在AP-MALDI检测过程中信号处理往往需通过平均化全部光斑区域的光谱能量以获得更可靠的结果，但经过平均化的结果准确性和重复性较差，参考意义低，不能用于量化。因此，相关解决方法必须从基质与分析物共结晶的均匀性入手，例如通过快速蒸发基质溶液或添加改性剂，但这些改进往往需要复杂操作或额外设备，难以实现现场分析效果的改善。近年来，液体基质的应用极大改善了辅助基质中共结晶不均匀问题，尤其是离子液体，受到越来越多研究者的青睐。离子液体是指在室温下呈液态，熔点低于100 ℃的盐，于2001年首次出现在辅助基质的报道中，但当时所用的室温离子液体因不具有显著的紫外吸收性质而未得到重视。随着科技进步，研究人员在此基础上进行了改进，通过等摩尔混合经典的酸性辅助基质(CHCA、DHB、SA)与不同的有机碱(吡啶、三丁胺、1-甲基咪唑)产生新的液体基质。这些新基质显示出很好的兼容性与分析性能，很大程度上改善了固体基质的“热点”问题。Shrivas团队将CHCA-丁胺与DHB-丁胺进行等摩尔混合得到新的离子液体基质，用于鉴别小鼠肝细胞和脑切片中的磷脂及其分布。采用质谱成像技术对新基质和普通基质进行对比，结果证明离子液体基质可有效改善共结晶不均匀问题，并且高重复性证实了此方法的有效性和可靠性。由于寡糖与传统基质中碎片离子的分子量较为接近，使用AP-MALDI区分和检测寡糖较为困难。Pei等分别考察了4种生物碱与DHB合成的离子液体基质，选择2，5-二羟基苯甲酸丁胺(DHB-BuN)作为基质用于分析寡糖样品，并证实该方法具有较好的灵敏度和重复性。在此基础上，对大豆和大豆叶直接切片后进行基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)成像分析，省去了繁琐的前处理过程，且使用该基质质谱检测背景干扰低，寡糖的分布清晰，重复性好。Ling等开发了一种由四甲基胍和THAP以3 ∶1混合而成的离子液体基质，优化后的基质表现出很好的重现性和耐盐性，可在负离子模式下有效降低磷酸化肽的碎裂，选择性地提升磷酸化肽的检出率。这进一步说明离子液体基质在基质辅助激光离子源中具有很大的应用潜力。

1.2.4 新型有机基质

尽管采用不同的添加剂或修饰方法可在很大程度上对现有基质进行改造，但开发新的有机化合物作为基质仍是该领域的热门方向，尤其是针对一些缺少质子化基团、稳定性差、极性大的目标物，因为这类目标物的质谱分析往往需要冗长繁琐的前处理程序。盐类物质在近年也被用作新基质。Chen等发现含氮物质在负离子模式下的检测性能更好，选择N-(1-萘基)-乙二胺作为新辅助基质在负离子模式下分析小分子化合物，结果表明与传统基质CHCA和DHB相比，新基质的碎片离子峰更少，灵敏度更高。Wang等使用香豆素类化合物作为基质用于疏水性化合物的分析，并比较了5种常见香豆素以及传统基质CHCA和DHB在MALDI中的分析性能，其中6，7-二羟基香豆素-3-羧酸对于疏水性化合物表现出更好的检测灵敏度、稳定性以及重现性。由于糖苷键的不稳定性，相应的分析检测方法往往使用碱金属添加剂来保持其结构稳定。此外，一些生物特异性的识别分子也被用于基质修饰，以提高方法选择性，如核酸适配体修饰、分子印迹修饰等。

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