单核增生李斯特氏菌近红外快检方法建立与应用（二）

2结果与分析

2.1近红外免疫层析试纸条定性检测

采用近红外荧光染料标记的双抗体夹心免疫层析试纸条检测单增李斯特氏菌。免疫层析反应结束后，以近红外荧光扫描仪测定检测线和质控线的荧光强度。在抗体垫上固定有近红外荧光标记的单克隆抗体和作为质控物的近红外荧光标记的IgG多克隆抗体。当含有单增李斯特菌的样品滴加到试纸条样品垫上后，靶标致病菌与抗体垫上的标记抗体结合，形成荧光标记物-标记抗体-靶标分子复合物。

复合物随溶液向试纸条前端迁移，当复合物迁移至检测线时，被固定于检测线上的抗致病菌抗原的另一株单克隆抗体所捕获。荧光标记的IgG多克隆抗体随溶液继续迁移，到达质控线时被固定于质控线上的山羊抗IgG多克隆抗体所捕获。检测中所使用的近红外荧光染料为发射波长位于775nm±5nm，激发波长为795nm±5nm的有机分子。若试纸条质控线区域出现荧光发射峰，则表明该试纸条有效，反之则无效；以同时出现检测线区域和质控线区域荧光峰为阳性结果，反之则为阴性。

如图2所示，根据该样品的定性检测结果，质控线区域峰值达到3800，检测线峰值达到2000左右；在质控线区域、检测线区域同时出现荧光发射峰，反应为阳性结果，说明该样品中含有单增李斯特氏菌，表明该荧光标记的单增李斯特氏菌试纸条可以使用，具有有效性。

2.2近红外免疫层析试纸条定量检测

按照1.3.5实验步骤，将稀释好的标准品分别加入试纸条待检，采用近红外荧光扫描仪进行扫描。若检测线区域、质控线区域均出现荧光峰表明检测结果为阳性。

以检测荧光峰值相应的样品浓度对数值作标准工作曲线(图3)。通过标准曲线图得出计算公式为Y=1.2452X+2.4362，r2=0.9722(X荧光检测值，Y是标准品浓度的对数值lg值)。

结果显示，单增李斯特菌标准品浓度在0.5×103CFU/mL至1.5×105CFU/mL时，荧光比值与浓度线性关系良好，即线性范围0.5×103～1.5×105CFU/mL。崔焕忠等采用胶体金免疫层析试纸条对自来水、生肉制品、蔬菜、冷冻虾仁等模拟样品的检测限为3.9×105CFU/mL。2014年潘秀华等研制的单增李斯特菌胶体金试纸条的灵敏度为2.4×105CFU/mL。

2.3传统方法检测

通过对标准菌株的实验结果观察，按照GB4789.30—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》传统检测方法得到的结果如图4所示。由图可以看出，采用传统检测方法检测结果为未增菌条件下，检测限为1.5×104CFU/mL。与传统检测方法相比，基于近红外荧光染料标记的免疫层析体系对靶标菌的灵敏度提高约30倍。

2.4近红外免疫层析试纸条特异性实验

利用近红外免疫层析试纸条对副溶血弧菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌进行检测。实验发现沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠埃希氏菌及副溶血弧菌检测线区域(如图5箭头所指示位置)均未出现发射峰，仅质控线区域出现发射峰，如图5所示。单增李斯特菌的检测线区域与质控线区域均出现发射峰，表明该近红外快速检测试纸条对单增李斯特氏菌的特异性好，与其他5个菌属无交叉反应。

2.5试纸条稳定性实验结果

将制备好的试纸条置于4℃条件下，放置20d，采用近红外荧光扫描仪进行定性检测，通过灵敏度和特异性判断试纸条的稳定性。结果如图所示6，将所研制的试纸条分别进行初始检测、20d后再次进行检测，同时出现检测线区域和质控线区域荧光峰为阳性结果。说明图6前面3个检测线区域、质控线区域为初始检测，后面3个检测线、质控线区域为20d后近红外荧光检测仪所测得结果。结果显示该试纸条灵敏度没有明显下降，特异性良好，稳定性较好。

2.6近红外免疫层析试纸条样本检测

按照传统检测法和所建立的近红外荧光法，对实验室30份食品样品进行检测，其中13份样品为添加单增李斯特氏菌样本。近红外免疫层析试纸条法检出阳性样品15份；传统检测方法的检出阳性样品13份(如表1所示)。

按照公式，特异性=真阴性/(真阴性+假阳性)×100%；灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)×100%

近红外免疫层析试纸条特异性a=17/(17+2)×100%=89.47%；灵敏度b=13/(13+0)×100%=100%。将2种方法进行符合性比较，近红外免疫层析试纸条检测结果发现2个样品近红外免疫层析检测结果为阳性，与传统方法检测结果不一致。通过计算比较两种方法的符合率=(30‒2)/30×100%=93.3%。

3结论

本研究研制的适用于现场快速检测的双抗体近红外荧光免疫层析试纸条，能在45min快速检测到样品中单增李斯特氏菌，灵敏度为0.5×103CFU/mL。可以看出，与常用的胶体金试纸条相比，本团队基于近红外荧光染料标记的免疫层析体系对靶标菌的灵敏度提高约200倍以上，因此该检测方法较其他方法信噪比高，灵敏度理想。本方法所涉的免疫层析试纸条及近红外荧光扫描仪均属于便携可移动装置，且整个检测过程可在45min内完成，适用于现场、即时、快速检测。相对于传统培养法5～6d的检测周期及繁琐的培养基配制等过程具有显著的时效性优势；相对于PCR及实时荧光定量PCR法等分子生物学方法则在仪器的检测速度、便携性及现场适用性上呈现明显优势。

在实际工作中，可以与经典常规方法进行互补，缩短检测时间，适合现场快速检测，在进出口食品安全检测方面具有良好的应用前景。2016年开始本团队陆续开发出近红外荧光免疫层析试纸条检测食源性致病菌，检测对象包括沙门氏菌、霍乱弧菌和副溶血弧菌等。通过研究发现近红外荧光免疫检测法灵敏度较高。采用近红外荧光免疫测定法，可以避免人为判读的错误，结果客观、准确，容易保存，为现场提供快速、准确的检测方法。下一步工作我们计划将食品样品的处理方法进行优化，以提高试纸条灵敏度和特异性，并将对方法进行完善，尽快研制出单增李斯特氏菌检测试剂盒可为口岸提供一种可靠稳定的快检技术。

相关链接：大肠埃希氏菌，金黄色葡萄球菌，李斯特氏菌，单核细胞