超声波辅助水提-蛋白酶法提取末水坛紫菜多糖的研究（一）

坛紫菜是我国南方沿海地区大规模人工养殖的重要经济海藻。坛紫菜可多次采收，第一次采收的坛紫菜俗称头水坛紫菜，第二次至第四次采收的坛紫菜分别称为二水、三水及四水坛紫菜，四水以后的坛紫菜通常称为末水坛紫菜。末水坛紫菜由于色泽差、口感粗、售价低、获利少，因而养殖者常放弃采收，导致其腐烂在海中，既浪费了资源，又污染了环境。然而，末水坛紫菜中依然含有较高的蛋白质、多糖、膳食纤维等营养成分，因此，高值化利用末水坛紫菜，具有重要的经济意义和生态意义。

由于末水坛紫菜中多糖含量很高，因此目前对该资源的深加工主要集中在多糖方面。陈美珍等测定出末水坛紫菜多糖含量为20.67％，他们用热水提取的多糖为分子量28.54kDa的单一组分，主要由半乳糖(83.12％)、3，6-内醚半乳糖(15.71％)和硫酸基(10.61％)组成。王贤等分别用热水法和微波法对福建平潭地区的末水坛紫菜提取多糖，提取率分别为4.037％和5.054％。谢飞等认为由于末水坛紫菜蛋白质多于多糖，因此采用常规方法难以去除蛋白，且多糖损失大。他们通过比较几种除蛋白的方法，认为用木瓜蛋白酶去除蛋白效果最佳，因此多糖提取率最高。

多糖提取方法很多，其中超声波辅助水提法由于多糖提取率高而受到重视。这是因为超声波的空化作用可破碎细胞，从而使多糖易溶出，且该法提取温度低、提取时间短，因而可避免多糖提出后的降解。基于此，本研究先采用超声波辅助水提末水坛紫菜多糖，再用木瓜蛋白酶去除粗多糖中的蛋白质，以期提高末水坛紫菜多糖提取率，并为末水坛紫菜多糖的深入研究和末水坛紫菜的深加工提供数据参考和技术支持。

一、材料与方法

1、原料与试剂

末水坛紫菜，取自湛江雷州东里镇；木瓜蛋白酶(酶活力80.0万IU／g)，北京鸿润宝顺科技有限公司；葡萄糖、苯酚、浓硫酸、无水乙醇等均为国产分析纯。

2、主要仪器设备

S-450D超声波细胞破碎仪(400W，20kHz)，必能信超声(上海)有限公司；兴盛XS-10B500克多功能粉碎机，东莞隆鑫机电设备有限公司；HH-6恒温水浴锅，江苏金坛市环宇科学仪器厂；UV-1240紫外可见分光光度计，岛津企业管理(中国)有限公司；TDZ5-WS离心机，湖南省湘仪实验仪器开发有限公司；202-3电热恒温干燥箱，郑州宏朗仪器设备有限公司；FE20K台式pH计，广州市怡华新电子仪器有限公司；透析袋MD34(3500Da)，北京中生瑞泰科技有限公司。

3、实验方法

（1）末水坛紫菜预处理

将末水坛紫菜清洗、去杂后剪碎，用无水乙醇浸泡24h脱脂，以利于多糖提取。浸泡结束后水洗末水坛紫菜，并于60℃烘干，最后粉碎过40目筛，收集备用。

（2）末水坛紫菜多糖的提取

称取4.0g末水坛紫菜粉末于烧杯中，加水搅拌均匀，然后置于超声波细胞破碎仪中进行超声波辅助水提多糖。提取结束后于3000r／min离心10min，收集上清液置于另一烧杯中，然后对上清液旋蒸浓缩至原体积的1／3。在浓缩液中加入适量木瓜蛋白酶充分水解蛋白质，然后将pH调到木瓜蛋白酶等电点8.75，使木瓜蛋白酶沉淀析出，5000r／min离心10min后，取上清液置入透析袋，蒸馏水透析24h以除去氨基酸及盐离子，透析期间第4、8、16h时分别换水一次。最后，将透析袋内的多糖溶液冻干，获得粉末状精多糖。

（3）末水坛紫菜多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标品建立标准曲线：Y=1.22571x-0.32267，R²=0.99447(y表示吸光度，x表示葡萄糖质量浓度)。将获得的粉末状精多糖用适量水溶解后测其吸光度，然后代入回归方程可求得多糖质量浓度。按下式计算多糖提取率：多糖提取率／％=[c×V／(m×1000)]×100，式中，c为多糖浓度(mg／mL)；V为多糖溶液体积(mL)；m为末水坛紫菜粉末质量(g)。

（4）超声波辅助水提多糖工艺优化

超声波辅助水提末水坛紫菜多糖，然后用2％(mg／mL)的木瓜蛋白酶在45℃下水解60min去除蛋白后获得精多糖。设计单因素试验分别考察提取温度(A)、提取时间(B)、水料比(C)三个因素对多糖提取率的影响。在此基础上，以多糖提取率为响应指标，对上述三因素设计L₉(3⁴)正交试验优化超声波辅助水提多糖工艺参数。

（5）木瓜蛋白酶去除蛋白工艺优化

采用最优超声波辅助水提工艺提取出末水坛紫菜多糖，然后用木瓜蛋白酶去除蛋白。设计单因素试验分别考察加酶量(D)、水解温度(E)、水解时间(F)三个因素对多糖提取率的影响。在此基础上，以多糖提取率为响应指标，对上述三因素设计L₉(3⁴)正交试验优化木瓜蛋白酶去除蛋白工艺参数。

二、结果与分析

1、超声波辅助水提多糖工艺优化结果

（1）单因素试验结果

提取温度、提取时间、水料比三个因素对末水坛紫菜多糖提取率的影响见图1。

由图1可知：(1)在提取温度40～70℃范围内，末水坛紫菜多糖提取率随温度升高而增大，但在60～70℃范围内，多糖提取率增加缓慢；此后随温度继续升高，多糖提取率逐渐减小。这可能是因为温度升高可加速多糖从组织细胞内溶出，温度升到一定程度时，多糖会出现降解，当多糖降解速度高于溶出速度时，多糖提取率便开始下降。(2)在超声波细胞破碎仪作用下，组织细胞被破碎导致多糖迅速溶出，可大大减少提取时间。提取时间为3min时，多糖提取率已达到6.9％，此后随着提取时间延长，多糖提取率增加缓慢，而在5min后，多糖提取率开始出现下降趋势。这是因为增加提取时间虽然可以使更多的多糖从细胞内溶出，但随着提取时间的延长，多糖受热水长时间浸泡可能会出现降解。(3)水料比在20:1～30:1(mL／g)时，多糖提取率随水料比的增大而快速增加，此后继续加大水量，多糖提取率增加缓慢。原因可能是水量增加有利于多糖溶出，但当水量增加到一定程度时，多糖溶解会趋于饱和而导致很难继续从细胞内溶出。另外，加水量不宜太多，否则会增加后续浓缩过程的能耗和时间。

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