荆州地区蚱广椒乳酸菌多样性解析及其分离株发酵特性的评价（一）

鲊广椒，也称为鲊辣椒、鲊金椒或鲊海椒，口感微辣且偏酸，在我国湖北、湖南、重庆和贵州等地颇为流行，常作为佐料用于菜肴的烹饪。由于各地用于鲊广椒制作的食材、工艺条件和气候环境不同，因而制作出的鲊广椒品质也不尽相同。湖北荆州地区的作广椒主要是以大米和红辣椒为主要原料，通过密封发酵制作而成。采用单分子实时测序技术，王玉荣对湖北省当阳地区鲊广椒细菌多样性进行了解析，结果发现，94.25％的细菌隶属于乳酸杆菌属，乳酸菌为鲊广椒中的优势细菌，究其原因可能在于鲊广椒发酵环境相对密封，发酵罐中氧气的含量相对较低，为乳酸菌的生长提供了适宜的条件。

由于产业化程度较低，加之其制作环境相对开放，除乳酸菌外鲊广椒中亦可能含有其他微生物种群。采用MiSeq高通量测序技术，王玉荣对湖北宜昌地区鲊广椒细菌多样性进行了解析，结果发现其含有大量的Staphyococus(葡萄球菌属)、Enterobacter(肠杆菌属)和Klebsiella(克雷伯氏杆菌)等条件致病菌。采用乳酸菌纯种发酵制备作广椒，可以改善自然发酵的诸多弊端，在提升食品安全性的同时，亦可以改善产品的品质，因而更符合消费者的消费需求。研究人员可采用电子舌和电子鼻等仿生技术对食品滋味和气味品质进行评价，具有结果准确且受主观因素影响小的优点，两种技术相结合更是广泛的应用于肉制品、调味品、蒸馏酒、豆瓣酱、果汁、牛奶和咖啡等食品品质评价中。

本研究从湖北荆州采集了10个鲊广椒样品，采用纯培养技术和分子生物学方法相结合的手段，在解析鲊广椒中乳酸菌多样性的同时，对其蕴含的乳酸菌菌种资源进行了分离鉴定。在使用乳酸菌分离株进行鲊广椒纯培种发酵的基础上，结合电子舌和电子鼻技术对产品品质进行了评价。通过本研究的实施，以期为湖北荆州地区鲊广椒微生物多样性的解析和后续鲊广椒产业化的推动提供一定的理论依据和菌株支持。

一、材料与方法

1、材料与试剂

鲊广椒：采集白湖北省荆州市城南菜市场和两湖农产品交易物流中心蔬菜批发市场，共采集10个；大米、辣椒、花椒、白胡椒、盐和白酒：购于襄阳市609航空航天研究所鑫源超市；MRS培养基和LB培养基：青岛海博生物技术有限公司；AxygenPCR清洁试剂盒：康宁生命科学吴江有限公司；DL2000Marker、PCRbuffer、rTaqDNA聚合酶和pMDl8-T克隆载体：宝生物工程(大连)有限公司；蛋白酶K和DNTPMix：北京全式金生物技术有限公司；十六烷基三甲基溴化铵、乙酸钠、乙醇、酚、氯仿和异戊醇：国药集团化学试剂有限公司；Escherichiacolitopl0：由鄂西北传统发酵食品研究所制备并保存；引物：27F(5’-AGAGTITGATCCTGGcTCAG-3’)和反向引物1495R(5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)：由天一辉远生物科技有限公司合成；电子舌测试用参比溶液、内部溶液、外部溶液和标准溶液：日本Insent公司。

2、仪器与设备

YL90-2磨面机：上海捷朗机电有限公司；DG250厌氧工作站：英国DonWhitley公司；LRH-150生化培养箱：上海-恒科学仪器有限公司；XFS-280手提式压力蒸汽灭菌锅：浙江新丰医疗器械有限公司；ECLIPSECi生物显微镜：日本Nikon公司；5810R台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；PTC-100PCR仪：美国ABI公司；FluorChemFC3化学发光凝胶成像系统：美国ProteinSimple公司；SA402B味觉分析系统，配备5个传感器：日本Insent公司；PEN3型电子鼻，配备10个金属氧化传感器：德国Airsense公司。

3、试验方法

（1）乳酸菌的分离

采用倍比稀释法将鲊广椒样品进行稀释，取稀释液涂布于添加1.0％CaC0₃的MRS固体培养基上，于厌氧条件下(85％N₂，5％C0₂及10％H₂)37℃培养48h，挑取形态不同且有透明圈的单菌落进行菌株分离。菌株纯化3代后，将革兰氏染色为阳性且过氧化氢酶实验为阴性的菌株判定为疑似乳酸菌菌株，菌体离心后加入浓度为30％的甘油，于-80℃超低温冰箱中冻藏备用。

（2）乳酸菌的鉴定

使用CTAB法提取疑似乳酸菌的DNA，并以DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系为：2.5μL10×PCRBuffer(含M9²⁺)，2μLdNTP(2.5mol／L)，正反向引物各0.5μL，0.2μLrTaq(5U／μL)，1μLDNA模板，18.3μL无菌水。PCR扩增条件为：95℃4min为预变性；95℃变性45S，55℃退火45S，72℃延伸90S，30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增结束后，取2.5μL的扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。使用清洁试剂盒将染色后有清晰明亮条带的扩增产物进行清洁，并连接到T载体中然后转化至Escherichiacolitopl0中，将鉴定结果为阳性的克隆子寄往武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序。将反馈后的测序结果拼接后在NCBI网站进行BLAST分析，选取相似度在99％及以上的序列进行系统发育关系分析，并建立系统发育树。

（3）鲊广椒的制作

将大米粉碎至粒度约为4～6mm，称取大米粉750g、花椒粉3.15g、胡椒粉3.15g、切碎的红二荆条辣椒225g和食盐75g，按照5×10⁶／g鲊广椒原料的比例分别接入乳酸菌菌泥，搅拌均匀后装入2L玻璃泡菜坛中并喷洒3mL白酒，纯水将泡菜坛封口后置于30℃培养20d。同时以不添加乳酸菌菌株的鲊广椒为对照。

（4）乳酸菌发酵鲊广椒滋味品质的评价

参考王玉荣的方法，并稍作修改。取鲊广椒样品50g添加150mL的去离子水在常温下浸泡30min后12000r／min离心10min，取上清液备用。使用电子舌对鲊广椒的酸、苦、涩、鲜和咸5个基本味，以及苦、涩和鲜3个基本味的回味进行测定。每个鲊广椒样品重复测4次，取后3次测试结果为原始数据，纳入后续分析。在进行样品测试时，将对照组鲊广椒样品各滋味指标的强度设置为0，添加乳酸菌制备的鲊广椒样品各滋味指标的强度减去对照组相对应指标原始强度的值，即为该样品滋味指标的相对强度。

（5）乳酸菌发酵鲊广椒气味品质的评价

参考王俊的方法，并稍作修改。取鲊广椒样品10g于样品瓶中，室温下平衡30min，使用电子鼻进行典型类型物质测定。进行样品测定时，传感器自动清洁时间为95S，样品测试时间为60S，每间隔一秒测定一个响应值，选取测试时间为49S、50S和51S时10个金属氧化电极对应响应值的平均值为原始数据，纳入后续分析。

（6）统计分析

使用曼-惠特尼检验对L.plantarum和肠球菌制备鲊广椒各品质指标差异的显著性进行分析，使用主成分分析(principalcomponentanalysis，PCA)和多元方差分析(multivariateanalysisofvariance，MANOVA)对L.plantarum和肠球菌制备鲊广椒品味的差异性进行分析。

使用BioEdit和MEGA7进行系统发育树构建；使用Matlab2010b软件进行数据分析；使用origin8.5绘图。

二、结果与分析

1、鲊广椒中乳酸菌的分离鉴定

采用纯培养技术，本研究从10个鲊广椒样品中共分离出22株疑似乳酸菌，其中13株为杆菌，9株为球菌，在对16SrRNA序列全长进行测序的基础上，其和模式菌株构建的系统发育树如图1所示。

由图1可知，13株杆菌可分为4个种，其中HUBAS52151、HUBAS52153、HUBAS52154、HUBAS52155、HUBAS52158、HUBAS52166、HUBAS52168、HUBAS52173和HUBAS52175均鉴定为Lactobacillusplantarum(植物乳杆菌)，HUBAS52152鉴定为Lactobacillusfarcimin括(香肠乳杆菌)，HBUAS52156鉴定为Lactobacillusfutsaii(福菜乳杆菌)，HBUAS52167和HBUAS52174均鉴定为Lactobacillusfermentum(发酵乳杆菌)。由图1亦可知，9株球菌可分为4个种，其中HBUAS52163和HBUAS52169鉴定为Pediococcuspentosaceus(戊糖片球菌)，HBUAS52164鉴定为Weissellaparamesenteroides(类肠膜魏斯氏菌)，HBUAS52171和HBUAS52172鉴定为Enterococcusfaecalis(粪肠球菌)，HBUAS52165、HBUAS52170、HBUAS52l77和HBUAS52l78鉴定为Enterococcusfaecium(屎肠球菌)。荆州地区作广椒中乳酸菌种群的构成如图2所示。

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