微波辅助法香茅草精油的提取及抑菌活性研究（一）

香茅草为禾科植物香茅的全草，呈柠檬香味，别名柠檬草，在我国的华南、西南等地均有分布。香茅草精油有较好的抑菌活性，其中的香叶醛和橙花醛已被证实为香茅精油中的抗菌活性成分。香茅草精油被用于配制牙膏、香水、香精、驱蚊剂、杀蚊剂、化妆品等工业日化用品，还用于合成薄荷脑、消毒制剂、抑菌剂等，而且在天然的食品防腐剂开发领域有较为广阔的应用前景。

云南是香茅草的重要的种植区，种植面积大，以往对其利用率不高，主要用于食用和中草药方面，目前很多学者已经证实其在化妆品、医药各方面的功效，但香茅油的提取率很低，目前已报道的提取方法有：水蒸气蒸馏法，超临界CO₂萃取法，索氏提取法，微波辅助法。

水蒸汽蒸馏法虽然设备简单，不易破坏有效成分，但提取率很低；索氏提取法的提取率高，但要加入有机试剂丙酮，会造成污染；超临界CO₂萃取法能保护有效成分，但设备属高压设备，投资成本大；微波法有提取时间短、节能、操作简单、出油率高的优点。为获得较高的出油率和较好的抑菌活性的香茅草精油，本文采用微波辅助水蒸气蒸馏法提取香茅草精油，并对提取工艺的优化，同时测定其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑制作用。为香茅草利用途径的开拓提供理论基础和技术支持。

一、材料与方法

1、材料与试剂

香茅草采于云南保山潞江镇。

金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。

氯化钠、石油醚、无水硫酸镁；牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂。

2、仪器与设备

高压蒸汽灭菌锅HVE-50，生化培养箱SPX-250B-Z型，UV2600双光束紫外可见分光光度计，气质联用仪TraceDSQ。

3、实验方法

（1）香茅草精油的提取

准确称取25g干香茅草叶部，按料液比加入一定体积的蒸馏水，浸泡12h后，在一定微波功率和微波时间下进行辅助加热5min，再加入一定量的NaCl和几粒沸石，混合均匀，转入500mL圆底烧瓶中，进行水蒸气蒸馏，蒸馏过程中记录香茅草精油的外观品质和出油量，蒸馏结束后，无水MgSO₄干燥，收集精油置于棕色瓶中，密封4℃储存备用。

出油率计算公式：

出油率（%）=（精油质量／香茅草千重量）x100%。

（2）香茅草不同部位的精油出油率比较

分别称取25g香茅草的干燥茎样、干燥叶样、鲜茎样、鲜叶样，浸泡12h后，在料液比1：15g／mL，NaCl质量浓度1g／L，微波功率350W，微波时间5min，准确称取25g干香茅草叶部，按料液比加入一定体积的蒸馏水，浸泡12h后，在一定微波功率和微波时间下进行辅助加热5min，再加入一定量的NaCl和几粒沸石，混合均匀，转入500mL圆底烧瓶中，进行水蒸气蒸馏，蒸馏过程中记录香茅草精油的外观品质和出油量，蒸馏结束后，无水MgSO₄干燥，收集精油置于棕色瓶中，密封4℃储存备用，进行香茅草精油的提取，并计算总精油提取率。

（3）单因素试验

选择料液比（A）、氯化钠质量（B）、微波功率（C）和微波时间（D）进行单因素实验。固定料液比1：15g／mL，NaCl用量1g／L，微波功率350W，微波时间5min，分别考察单因素料液比（1：10、1：15、1：20、1：25）、NaCl质量浓度（0.5g／L、1g／L、1.5g／L、2g／L、2.5g／L）微波功率（210W、350W、490W、700W）、微波时间（3min、4min、5min、6min）。

称取25g干香茅草叶部，按料液比加入一定体积的蒸馏水，浸泡12h后，在一定微波功率和微波时间下进行辅助加热5min，再加入一定量的NaCl和几粒沸石，混合均匀，转入500mL圆底烧瓶中，进行水蒸气蒸馏，蒸馏过程中记录香茅草精油的外观品质和出油量，蒸馏结束后，无水MgSO₄干燥，收集精油置于棕色瓶中，密封4℃储存备用，进行香茅草精油的提取，并计算总精油提取率。

（4）正交实验

根据正交试验法以料液比A（g／mL）、NaCl质量浓度B（g／L）、微波功率C（W）、微波时间D（min）为4个因素，每个因素设3个水平进行L₉（3⁴）设计正交实验确定香茅草精油提取的最佳条件。具体因素水平如表1。

（5）香茅草精油的GC-MS分析

将精油用色谱纯级的甲醇配制成1mg／mL，无水硫酸钠震荡干燥后进样。GC-MS分析条件：

DB-17毛细柱（30Mx0.25mmx0.25μm），升温程序：起始柱温50℃，保持4min；以5℃／min升温至70℃；20C／min升温至120℃；10℃／min升温至170℃；5℃／min升温至200℃；40℃／min升温至280℃。载气为氦气，流量：1.0mL／min，进样口温度：230℃，进样量1μL。质谱条件：离子源（EI），电轰击能量70eV，离子源温度：200℃。

（6）香茅草精油的抑菌活性测定

①菌种活化及菌悬液的制备用

接种环挑取适量的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌于LB液体培养基中进行活化，37℃培养24h。挑取-环已活化的菌苔放入100mL无菌生理盐水中，摇匀菌悬液，150r／min振荡培养，37℃培养24h。

②香茅草精油的抑菌效果测定

采用滤纸片法测定抑菌活性，每皿设计3片滤纸片。滤纸片法判定标准极敏：抑菌圈直径＞20mm，高敏：抑菌圈直径15～19mm，中敏：抑菌圈直径10～15mm，低敏：抑菌圈直径＜10mm。

具体方法为：制备牛肉膏蛋白胨琼脂平板，用无菌移液器吸取200uL菌悬液（1.0x10⁶～10⁷CFU／mL）于平板上，采用涂布棒均匀涂布。用直径为8.0mm并已灭菌后的滤纸片放入香茅草提取物中，浸泡1～2min后，将滤纸片放入培养基表面，每板放3张。将培养皿倒置于恒温培养箱中，于37℃下培24h，观察细菌生长情况，采用十字交叉法测定样品的抑菌圈直径，再对3种菌的无菌水空白和稀释溶剂（60%乙醇）对照。实验重复3次，取其平均值为测定结果。

③香茅草精油最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的测定

采用2倍稀释法，测定具有最大抑菌圈直径香茅草提取物的MIC和MBC。以60%乙醇为溶剂，将香茅草的提取物配制成一系列梯度浓度的样品溶液，分别为10.5、2.5、1.25、0.62.0.3、0.15.0.075mg／mL。量取0.1mL不同浓度的样品溶液和0.1mL（1.0x10⁶～10⁷CFU／mL）供试菌菌悬液混合，混合液加入到装有10mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管中，37℃下恒温培养24h后，各取1mL培养液涂布在平板培养基上，将各试管置于37℃下培养24～48h，观察细菌生长情况，以完全无菌生长的浓度为其MIC。分别从样品浓度不低于MIC的各试管中取1mL培养液于营养琼脂平板上，涂布均匀后于37℃下继续培养24h，观察细菌生长情况。以仍无菌生长或菌落总数小于5的浓度为样品的最低杀菌浓度。

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