双水相体系萃取纯化紫甘蓝色素（一）

发布时间：2021-03-09 12:58 编辑者：周世红

紫甘蓝又名赤甘蓝、红甘蓝，属于十字花科，芸薹属甘蓝种的一个变种。十字花科植物当中含有较为丰富的多酚类物质，紫甘蓝中的多酚类化合物主要是花青素，花青素在植物体内主要以糖苷的形式存在，紫甘蓝中的花色苷类化合物主要为矢车菊色素的糖苷。花青素具有抗氧化、抗癌和降血糖等生理活性，同时紫甘蓝花青素在酸性到中性范围内可以实现颜色由红到紫的转变，可以广泛应用于糖果、饮料等食品生产当中，因此将紫甘蓝花青素开发成为食品添加剂具有很高的社会效益和经济效益。

双水相萃取是一种新型的物质分离技术，与传统分离方法相比，具有条件温和、产品活性损失小、分离步骤少、无有机溶剂残留、操作简单等优点，国内外广泛应用于蛋白质的纯化和抗生素的提取，近些年来逐渐应用于天然色素的分离纯化研究，国内对于使用双水相萃取纯化紫甘蓝色素的研究相对较少，国外有相关的报道，但并未对其萃取条件进行优化。

紫甘蓝色素生产时，粗提液中含有大量的糖类杂质，极大地影响了色素的品质和稳定性。传统工业对于植物花青素的提取主要采用酸水浸提法、溶剂法，还有超声波法。花色苷溶液中含有大量的单糖、二元糖、低聚糖和多糖等杂质。目前，柱色谱、高速逆流色谱和大孔吸附树脂广泛应用于花青素的分离、纯化，可以实现色素与其糖类物质的分离，但与双水相萃取相比，成本较高、时间较长、对操作要求严格。因此使用双水相萃取的方法实现植物花青素与其糖类杂质的分离属于一种新型、快速、低成本的操作方式。本研究尝试使用双水相萃取技术，将紫甘蓝色素与糖类物质分离，通过选择性系数表征此方法的有效性。

一、材料和方法

1、实验仪器

pH211酸度计；TDL-60B低速大容量离心机；HY-6双层振荡器；752S紫外可见分光光度计；AR1530分析天平。

2、实验材料

紫甘蓝；PEG6000配制成400g／L；苯酚为优级纯；其他试剂均为分析纯。

3、分析方法

（1）紫甘蓝色素属于花色苷类，按照美国化学工程师协会（AOAC）对花青素类天然色素中花色苷总量的方法进行测定，以矢车菊-3-葡萄糖苷计。

式中：

吸光度A=（A₅₂₀-A₇₀₀）_pH1.0-（A₅₂₀-A₇₀₀）_pH4.5

M：矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔质量，449.2g／mol；

D：样品储备液的稀释倍数；

1：光路长，cm，测试中采用1cm光路长的比色皿；

ε：26900，矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数，L·mol^-1·cm^-1；

1000：由g换算成mg的转换系数。

（2）使用苯酚-硫酸法对上下相中总糖含量进行测定。

（3）选择性系数k的计算。

式中：

K_花：花青素的分配系数；

K_糖：多糖的分配系数；

C_上花：上相中花青素的质量浓度，mg／L；

C_下花：下相中花青素的质量浓度，mg／L；

C_上糖：上相中糖类物质的质量浓度，mg／mL；

C_下糖：下相中糖类物质的质量浓度，mg／mL。

4、试验方法

（1）紫甘蓝色素粗提液制备

取适量紫甘蓝洗净、切碎，使用榨汁机榨取原汁，100目滤布过滤，3000r／min离心15min，取上层清夜冷藏保存，使用前调pH。

（2）双水相体系建立

固定体系质量为30.0g。在50mL离心管中分别加入一定质量的硫酸铵和PEG6000原液，加入一定质量预先调过pH的色素粗提液，加水补至体系质量为30.0g，置于振荡器上300r／min于室温下震荡10min后取下，读取上下相体积，用移液管分别移取上下相溶液于30mL比色管中。

（3）花色苷含量的测定

精密吸取上下相溶液，分别用pH=1.0的氯化钾缓冲溶液和pH=4.5醋酸钠缓冲溶液稀释适当倍数，以蒸馏水做空白，分别在520nm和700nm下测吸光值。计算上下相中花色苷含量，而计算出K_花。在700nm波长下测定吸光度值是为了校正混浊对测定结果的干扰。

（4）多糖含量的测定

以葡萄糖为对照，采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量。回归方程为：y=8.1114x-0.0069，R²=0.9983。分别精密吸取上下相样品稀释液1.0mL于试管中，加入5%的苯酚溶液1.0mL，迅速加入浓硫酸溶液5.0mL，摇匀，放置10min后于40℃水浴加热10min，取出后冷水浴5min，以相应试剂为空白，在490nm处测定吸光度，计算得到K_糖。