基于GC-MS分析不同品种小米代谢产物及代谢途径（一）

基于GC-MS代谢组学方法研究了同一产地不同品种小米的代谢产物。用甲醇溶液提取极性代谢组份，N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化处理，通过GC-MS分离鉴定代谢产物的。结果表明，同一产地两个不同品种小米共发现了53种代谢产物。古龙小米（GL）有48种代谢产物，其中优势代谢产物为亚油酸、2-亚麻酰基-rac-甘油；禾绅小米代谢产物有32种，优势代谢产物为亚油酸、甘油。对比发现，古龙小米有21种差异代谢产物；禾绅小米有5种差异代谢产物。对两个品种小米差异代谢产物的代谢途径初探，发现古龙小米的葡萄糖代谢途径、脂肪酸代谢途径、氨基酸代谢途径和三羧酸循环都比禾绅小米对应的代谢途径更活跃，推测古龙小米的代谢产物多是因为其代谢速率快于禾绅小米（HS）的代谢速率。
杂粮（coarse cereals）是具备“天然、绿色、营养、健康”品类特征的一类粮食。杂粮营养丰富，其营养价值大多优于主粮(小麦和水稻)。当前，我国政府实施的“健康中国”战略为健康食品市场发展提供了十分有利的政策机遇和空间，杂粮作为很好的营养素来源也是未来健康食品的主力军，未来可期。随着我国居民膳食要求的安全化向营养均衡的深入，对“杂粮”食品的要求也更“深入化、精细化、营养均衡化”。小米（Setaria italica (L.) Beauv. var. germanica (Mill.) Schrad.）是杂粮的一种，是北方广泛种植的杂粮作物之一，它具有一定的保健功能，深加工后能生产出易消化、高营养、高附加值的产品。

代谢组学是研究生物体内内源性代谢产物及其变化规律的一门科学。代谢组学在食品中的应用主要是研究食品代谢成分 [9,10]，日渐成为探索食品独特的品质最方便的方法之一。气相色谱-质谱结合代谢组学技术已被广泛应用于食品、医药、化工等各个领域，如大米代谢产物[12]的产地鉴别，绿豆代谢产物分离鉴定等。

本文利用GC-MS联用技术分离鉴定同一产地两个不同品种小米的代谢产物，分析了两种小米的差异代谢产物和各自的优势代谢产物，进一步探讨了代谢途径的差异。本研究为小米的选育和品种改良提供参考，同时相应数据也可作为小米产品精深加工利用的依据。

1材料与方法

1.1 材料与试剂

在肇源县古龙镇进行的田间试验获得的小米样品，品种分别为：古龙贡米（GL）、禾绅小米（HS）在相同田间管理条件下同时生长，同时收获，收货后储藏在-80 ℃冰箱备用，三个生物学重复用于代谢产物测定。

N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)，美国麦克林公司；分析纯甲氧胺盐酸盐、色谱级吡啶(≥99.9%)，美国Sigma-Aldrich公司；色谱级甲醇、乙腈、异丙醇，美国赛默飞世尔科技公司，代谢产物标准物质，美国Sigma-Aldrich公司和国家药品和生物制品控制研究所（北京，中国）；色谱级用水，美国米利波尔公司的Milli-q水净化系统。

1.2 仪器与设备

三重四极杆型GC-MS-TQ8040(配备的EI离子源)，日本岛津技术有限公司；自动进样器为AOC-5000，日本岛津技术有限公司；CR3i multifunction型离心机，美国赛默飞世尔科技公司；DGG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；DRP-9082型电热恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司；氮吹浓缩装置MTN-2800D，天津奥特塞恩斯仪器有限公司；1000μL、200μL移液枪，赛默飞世尔科技公司。

1.3实验方法

1.3.1 小米样品预处理

选取完整、成熟的小米样品，放入研钵研磨，研磨好的粉末样品储存于-80 °C冰箱待分析。

1.3.2 代谢产物提取

分别称取50 mg粉末小米样品于2 mL EP管，加入800 μL 80%甲醇和10 μL内标（2-氯苯丙氨酸）移入EP管快速涡旋30 s混匀，均质放入超声波清洗机35 °C超声9.0 min，超声提取过程每1min剧烈振摇1次，而后置于4 °C离心机，12000 r/min离心10 min，离心后取200 µL上清液转移至GC进样小瓶（1.5 mL自动进样瓶），氮吹。

1.3.3 衍生化处理

取30 µL甲氧铵盐酸吡啶溶液至浓缩后的样品中，快速混匀至完全溶解，置于37 °C恒温箱1 h，取出后加入30 µL的三氟乙酰胺（BSTFA）在70 °C烘箱1 h进行衍生化处理。

1.3.4 GC-MS分析

（1）色谱条件

用自动取样器注入1 µL样品溶液，仪器参数设定为：进样口温度280 °C，EI 离子源温度230 °C，四极杆温度150 °C，高纯氦气（纯度大于 99.999%）作为载气，不分流进样，进样量1.0 μL。升温程序为：初始温度80 °C，维持2 min，10 °C /min 的速度升至320 °C，并维持6 min，然后在80 °C下温度平衡6 min，然后再注入下一次样品。

（2）质谱条件

离子源温度230 ℃，接口温度300 ℃，溶剂切割时间2 min，采集模式Q3 Scan，采用全扫描模1.3.5数据分析与绘图得到的数据与美国国家标准与技术研究所（NIST）标准谱库对比分析，得到的代谢产物信息在京都市基因与基因组百科全书（KEGG数据库）中搜索比对，确认代谢产物和代谢途径，文中的表格运用Excel表格绘制成三线表，图采用Origin绘图工具制作完成。

2 结果与分析

2.1 GC-MS的代谢产物的分离与鉴定

古龙贡米（GL）和禾绅小米（HS）的GC-MS总离子流图如图1和图2所示，由代谢谱图中分离度、分辨率以及基线的稳定性来看，本次实验分离鉴定方法的条件选择是有效的，两谱图的总离子流图大致相似，但是在25.0 min ~ 27.0 min时间段存在不同。

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