酱香大曲中高温放线菌的筛选及基因组解析

发布时间：2024-03-12 10:17 编辑者：陈丹

“曲乃酒之骨”，酱香型高温大曲在发酵条件下富集了丰富的功能微生物，在生产过程中为整个酱酒酿造体系提供了微生物、酶系、风味及其前体物。高温放线菌是一类革兰氏阳性、化能异养的微生物类群，能够在极端环境下生存和繁殖，能代谢产生酯化酶、淀粉酶、磷酸酶等多种酶和风味及其前体物。该菌在酱香型白酒酿造体系中属于一类具有重要应用潜力的微生物资源，其在白酒酿造体系中的功能尚不清楚。本课题组在前期研究中也成功建立了一种从酱香大曲中分离、筛选高温放线菌的方法，从酱香型大曲中分离鉴定了多株高温放线菌，证实这些菌株具有良好的产吡嗪风味组分能力，并对其代谢产吡嗪的途径及机理进行解析。

近日，基于课题组前期的工作，贵州大学酿酒与食品工程学院对酱香型高温大曲中的高温放线菌进行分离筛选，结合多相分类学技术进行菌株鉴定，并利用第二代Illumina和第三代PacBio结合的测序技术对所筛选菌株进行全基因组测序，从基因组层面解析其潜在的代谢功能特性，分析该菌株代谢典型风味组分的潜在机理，旨在为今后继续深入解析高温放线菌类群微生物产风味物质，特别是四甲基吡嗪的生物合成代谢途径及机理提供参考。

1 菌株分离筛选及鉴定

1.1 菌株的形态学特征

从酱香高温大曲中分离得到1 株纯种菌株FBKL4.014，根据菌落形态特征初步判断其可能归属于高温放线菌。

菌株宏观形态学观察结果显示，该菌株长势良好，在培养基正反两面表现出的生长趋势不同，菌落总体呈缺刻圆状、突起、有较多皱褶、质地干燥致密，基内菌丝呈浅黄色，气生菌丝呈乳白色且较为发达，无可溶性色素产生，该菌株的菌落形态具有高温放线菌培养的典型特征。高温放线菌FBKL4.014的微观形态特征如图1B所示，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》分析，发现其菌丝体较短，形状不一且黏在一起呈簇状，呈圆球形的分生孢子直接着生于菌丝体上，分布于菌丝体两侧，其中有分支的孢子梗长度较短。

1.2 菌株的最适生长温度

实验结果表明，菌株FBKL4.014在45～50 ℃条件下生长最旺盛，在55～60 ℃高温范围内仍能够缓慢生长，37 ℃时该菌株能正常生长，但在30 ℃时不生长。Wang Xueshan等和颜林春的研究表明高温放线菌属大多可以生长在最高温度可达60～65 ℃的高温发酵环境中，因此，菌株FBKL4.014在耐热性方面与高温放线菌具有很高的相似度，而这也与其分离环境——酱香大曲的高温发酵环境密切相关。

1.3 菌株的生理生化特征

生理生化分析表明，高温放线菌FBKL4.014为革兰氏阳性菌，该菌株可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，并能使牛奶凝固但不胨化，使明胶产生液化现象，同时该菌株能水解淀粉和纤维素，由此推测该菌株能够代谢产生淀粉酶和纤维素酶，具备将大分子原料降解为可发酵性糖的潜能，有助于推动整个酿造过程的顺利进行。碳源利用实验结果显示，该菌株能够有效利用葡萄糖、海藻糖、D-棉子糖、D-甘露醇和D-山梨醇等碳源进行生长代谢，对麦芽糖表现出弱利用特征，不能利用乳糖和肌醇两种碳源。此外，该菌株能够利用硫酸铵和磷酸氢二铵两种无机氮源和酪氨酸，对尿素表现出弱利用性，不能利用脯氨酸、苏氨酸、谷氨酸和甘氨酸。

1.4 菌株16S rRNA基因系统发育分析

高温放线菌FBKL4.014基因组DNA片段长度约23 kb，经PCR扩增、拼接后的16S rDNA序列有效片段长度约为900 bp，与GenBank、EzTaxon等数据库中相似菌株的16S rDNA序列进行比对分析，并在种分类学水平搜索序列相似性，结果显示菌株FBKL4.014与莱斯氏属下糖莱斯氏菌（Laceyella sacchari）序列相似性最高；通过构建系统发育树，发现高温放线菌FBKL4.014与L. sacchari JF819833聚类在同一个分支上，其序列同源性为99.78%，因此判断该菌株在种水平上极有可能为L. sacchari。

2 L.sacchari FBKL4.014全基因组结果分析

2.1 菌株FBKL4.014基因组的一般特征

L. sacchari FBKL4.014基因组信息已上传NCBI GenBank数据库中，登录号为CP103866.1。对Illumina NovaSeq和PacBio Sequel下机测序数据进行联合拼装，得到完整的基因组序列。L. sacchari FBKL4.014基因组序列全长3.35 Mb，GC含量为48.67%，共预测到3 328 个蛋白编码基因，包括97 个tRNA、31 个rRNA（10 个5S rRNA、11 个16S rRNA、10 个23S rRNA）和36 个ncRNA编码基因，预测到11 条CRISPRs结构，测序深度为433×。利用CGView软件绘制了FBKL4.014基因组圈图。此外，通过NCBI平台查阅到其他糖莱西氏菌的GC含量大多在47%～49%之间，与本研究菌株所测得的GC含量（48.67%）接近，进一步证实该菌符合高温放线菌菌属GC含量低的特征。

2.2 菌株FBKL4.014基因组功能注释结果

利用BLAST在线比对分析工具将FBKL4.014的测序结果分别与NR、直系同源蛋白分组比对（eggNOG）、KEGG、Swiss-Prot、GO和Pfam数据库进行比对分析，获取注释到的蛋白编码基因数量分别为3 325、2 580、1 649、2 301、2 150 个和2 497 个；其中，在TCDB和PHI数据库中注释到的基因数较少，分别为474 个和553 个。此外，在CAZy和CARD数据库中分别注释到72 条和56 条基因信息。

2.3 eggNOG（COG）数据库基因注释分析

eggNOG（COG）数据库的比对分析结果显示，在数据库的所有2 5 个功能分类中， FBKL4.014共有19 类2 580 个基因得到了注释，占注释基因总数的77.52%。其中具有潜在生物学功能的基因注释结果最为丰富，共721 个，占注释基因总数的27.95%，这也为今后针对高温放线菌未知基因组信息的进一步挖掘提供可能。其次，氨基酸转运与代谢存在215 个注释结果，占注释基因总数8.33%；有研究表明酱香大曲中氨基酸代谢的活跃程度总体较高，酿酒原料中含有丰富的蛋白质，微生物通过氨基酸代谢、转运途径分解原料中的蛋白质，不仅可以为微生物生长提供必须的能量物质，也可以为酒体提供风味及其前体物。结合课题组前期的工作，这一研究结果的发现也说明在发酵体系中菌株FBKL4.014可能与酱香型白酒中含氮化合物的形成密切相关。

2.4 GO数据库基因注释分析

GO数据库的比对结果表明，菌株基因组共有2 150 个蛋白编码基因得到注释，占注释基因总数的64.60%。在GO数据库生物过程、细胞组成、分子功能三大功能分类数据库中，生物过程、细胞氮化合物代谢过程、生物合成过程和小分子代谢过程这4 个途径富集的基因数量最多，分别富集到2 030、789、753 个和579 个基因。有研究表明，在酱香型白酒高温酿造体系下，随着发酵温度升高，大曲中微生物丰度随之降低，因此以菌株FBKL4.014为代表的一类嗜热菌的正常生物合成和代谢活动对推动酱香型白酒整体酿造进程意义重大，尤其是细胞氮复合代谢过程富集到较多的基因，也与前期该菌株能将硝酸盐还原为亚硝酸盐以及利用硫酸铵和磷酸氢二铵等无机氮源的研究结果高度相关，初步揭示该菌株具有将无机氮转化为如游离氨等某些含氮风味物质前体物的潜力。碳水化合物代谢过程和分解代谢过程也分别富集了113 个和272 个基因，表明该菌株可能参与到酿酒原料中淀粉、纤维素及其他有机大分子物质的分解代谢过程，是酒体中风味及其前体物的潜在来源。此外，细胞、细胞组成、细胞内和细胞质4 个途径分别富集到686、523、510 个和396 个基因；分子功能、离子结合和DNA结合3 个途径也分别富集到1968、690 个和336 个基因。

2.5 KEGG数据库注释分析

KEGG数据库中FBKL4.014共有1 649 个蛋白编码基因注释到8 个层级的205 条通路中，占基因总数的49.55%。分析结果表明代谢途径富集到的基因数量最多，共1 085 个，其中有19 个较为完整的代谢途径，总体上表现出氨基酸代谢活动较为活跃的结果。

进一步通过KEGG数据库氨基酸代谢通路分析，发现菌株具备丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、色氨酸和苏氨酸等19 种氨基酸代谢途径。对氨基酸代谢通路的进一步分析发现，天冬氨酸、丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、谷氨酸和天冬酰胺可由糖类物质生物转化而成，丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸既可以由糖类物质生物合成，也可以由前述的6 种氨基酸通过生物转化合成。从FBKL4.014注释结果发现、亮氨酸、精氨酸、赖氨酸和酪氨酸只能通过相应氨基酸生物转化而不能由糖类物质合成，这与张巧玲等的研究结果一致。氨基酸代谢在白酒酿造体系中极为重要，主要表现在3 个方面：一方面氨基酸是酱香型白酒中风味前体物的重要来源，可代谢产生相应的醇类物质作为酒体中酸类和酯类物质形成的重要前体，如亮氨酸代谢生成异戊醇、异亮氨酸代谢产生活性戊醇、酪氨酸代谢产生酪醇、缬氨酸代谢产生异丁醇、苯丙氨酸代谢产生2-苯乙醇等。另一方面氨基酸本身就是酱香型白酒中风味物质的直接来源，通过代谢产生内酯、大马士酮和香叶基内酮等风味物质。第三氨基酸与还原糖在高温条件下发生美拉德反应生成呋喃类衍生物、吡咯类衍生物和醛酮及吡嗪类衍生物。因此，菌株FBKL4.014 KEGG注释分析结果也初步表明其在酱酒酿造体系中可能与一些含氮风味组分的产生密切关联。

FBKL4.014基因组中GH15家族的葡萄糖淀粉酶（EC 3.2.1.3）是水解淀粉的主要酶，在白酒酿造中可将原料中的淀粉水解为葡萄糖，一方面葡萄糖为酵母菌、细菌等微生物生长代谢提供营养物质和能量，推动发酵过程的进行；另一方面葡萄糖经糖酵解、三羧酸循环、丙酮酸代谢等途径产生氨基酸、有机酸等酒体风味及风味前体物。此外，GH3家族的β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）是纤维素降解的关键酶，通过水解纤维素非还原末端β-D-糖苷键形成葡萄糖。这也进一步证实了前期菌株生理生化特征有关菌株能产淀粉酶和纤维素酶的推测。总之，从CAZy分析角度对菌株FBKL4.014降解淀粉、纤维素等碳水化合物能力的明确，再次表明高温放线菌类群在推动酱香型白酒酿造顺利进行的过程中具有一定的潜在作用。

2.6 FBKL4.014四甲基吡嗪合成相关基因分析

白酒酿造体系中的四甲基吡嗪可通过微生物代谢产生，乙偶姻和游离氨是其关键前体物。因此四甲基吡嗪的代谢可分为两部分：1）吡嗪半环碳骨架化合物的合成；2）吡嗪含氮基团结构的形成。一方面，酿酒原料中的糖类物质在微生物作用下，经糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas，EMP）途径产生丙酮酸，丙酮酸通过乙酰乳酸合酶（EC 2.2.1.6）转化为α-乙酰乳酸，随后通过乙酰乳酸脱羧酶（acetolactate decarboxylase，ALDC）脱羧转化为乙偶姻（半环碳骨架化合物）；另一方面，蛋白质被蛋白酶水解成游离氨基酸，经氨基酸代谢进一步转化为游离态氨（含氮基团）；半环碳骨架化合物和含氮基团通过非酶促反应生成四甲基吡嗪。

3 结论

从酱香型高温大曲中筛选到1 株高温放线菌FBKL4.014，经形态学、生理生化特征、16S rRNA基因系统发育树鉴定，确定其可能为高温放线菌科、莱斯氏菌属下的L. sacchari。同时，利用第2代和第3代结合的测序技术完成L. sacchari FBKL4.014基因组测序工作，测序结果表明，L. sacchari FBKL4.014染色体基因组序列全长3.35 Mb，GC含量48.67%，测序深度433×，共预测到3 328 个蛋白编码基因，为后续进一步对其进行功能性研究提供数据支持，同时希望为酱香型白酒酿造体系中其他未培养微生物筛选方法提供参考。

通过全基因组测序及基因组解析，发现了L. sacchari FBKL4.014基因组上葡萄糖淀粉酶（EC 3.2.1.3）、β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）等碳水化合物活性酶编码基因的存在，证实其可能为该菌株参与酿酒原料中碳水化合物分解代谢的关键证据。KEGG数据库注释分析结果进一步显示该菌株基因组中有较完整的氨基酸代谢途径，说明该菌株氨基酸代谢活动也可能非常活跃；酱香型白酒中含氮化合物高是其典型的风格特征，其中，细胞氮复合代谢过程可能是该菌株将环境中的无机氮转化为某些风味前体物的关键途径，无疑表明菌株FBKL4.014很可能也是酱香型白酒中含氮物质的重要微生物来源。此外，该菌株基因组中还存在四甲基吡嗪合成的关键酶编码基因，同时针对ALDC和2,3-BDH尚未在该菌株基因组中被发现的事实，推测该菌株可能存在尚未被发现的特殊的四甲基吡嗪生物合成完整途径，也为今后酱香型白酒中风味组分在高温放线菌中的生成机理研究提供了基因层面的数据支持。本研究有助于发掘酱香大曲中高温放线菌的功能应用价值，为后续高温放线菌功能特性的确定与资源挖掘奠定了基础。