硝化菌的测定

一、测定意义

在通气良好的土壤中，以肥料形式施入土壤和有机氮矿化产生的铵态氮会在微生物的作用下很快转化为硝态氮，这种过程即为硝化作用。测定土壤硝化微生物数量，对了解土壤中氮素转化、供应状况、氮素的植物有效性和移动性，具有一定意义。

二、方法选择的依据

土壤中的硝化微生物有自养的，也有异养类型，在绝大多数土壤中，硝化过程是由自养硝化细菌完成的。在酸性土壤中，有时也有相当数最的异养硝化微生物。

自养硝化细菌在氨氧化为亚硝酸进而氧化为硝酸的过程中获得的能量，用于CO₂的固定和生命代谢活动。这类微生物又分为亚硝酸细菌(氮氧化细菌)和硝酸细菌(亚硝酸氧化细菌)。前者参与氨氧化为亚硝酸的过程，后者能够将亚硝酸进一步氧化为硝酸。

异养硝化微生物能够利用无机或有机氮化合物并将氨或有机胺化合物氧化成亚硝酸和硝酸。在异养硝化过程中，这些微生物一般不需要从这一过程获取能最，至少不是将其作为唯一的能源。异养硝化微生物包括细菌、真菌和放线菌，主要在酸性土壤中参与硝化过程，而且反应速率较慢，但现有的硝化抑制剂对这类微生物基本不起作用。

三、测定原理—最大可能(或然)计数(MPN)法

自养硝化微生物在土壤中分布非常广泛，只是在酸性土壤中活性较低。因此，用正常土壤样品测定的硝化徽生物基本上是自养硝化细菌，然而，与异养硝化微生物相比，自养硝化细菌在培养基中生长非常缓慢，难以在固体培养基上生长，导致分离、纯化和直接测定比较困难。因此，常用最大可能计数法，即通过概率统计的方法间接地估计土壤中硝化微生物群体的丰度。

最大可能计数法又称最大或然计数法或稀释频度计数法，适用于测定在一个混杂的微生物群中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。该方法系经过一系列稀释，直到取少量稀释液，接种到适宜的选择性液体培养基，经过一定时间的培养，对产物进行定性检测。但该方法要求在稀释系列中，最后一个稀释度的所有重复间都没有待测菌生长。

菌液经过多次10倍稀释后，一定盈菌液中可以极少或无菌，选择5个连续的稀释度，每个稀释度取3个～5个重复接种于适宜的液体培养基中。培养后，分别记载结果得出数量指标，即取稀释系列中所有重复管都有细菌生长(或生化反应为正者)的最后稀释度为数量指标的第一位数字，再取两个连续的数即为数量指标。由表查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。例如，硝化细菌有5个重复，稀释度为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀释液中出现生长的管数分别为5,5,5,4,1,0，则数量指标为“5,4,1”。查表可得细菌个数的近似值为17.0。那么。1mL原菌液中的活细菌数=17.O×10,000=1.7×10⁵个。计算每克土壤中的活菌数,可按下式计算:

四、氨氧化细菌的测定

1、方法原理

经过一定时间培养，利用氨氧化细菌在硝化过程中质子的释放并导致介质pH的改变，估计氨氧化过程的存在和完成的时间，然后通过检测氨氧化的产物NO₂^-和NO₃^-(分别用Griess和二苯胺)，最终确定单个试管中是否有氨氧化微生物。最后，用最大可能计数法估计土壤中氨氧化微生物的数量。

2、仪器

高压灭菌锅；恒温培养箱；匀浆机；高压灭过菌的10mL试管和150mL三角瓶；比色盘。

3、试剂

（1）培养基备用液：用蒸馏水或去离子水按下列浓度分别配制各组分，贮存备用：

（2）培养基:分别取10.0mL(NH₄)₂SO₄溶液、1.0mLCaCl₂·2H₂O溶液,1.0mLMg-SO₄·7H₂O溶液、5.0mL溴百里酚蓝溶液(pH指示剂), 7.5mLKH₃PO₄溶液、1.0mL鳌合铁溶液和1.0mL微量元家溶液混合，用碳酸钾溶液〔p(K₂CO₃= 20g·L^-1〕调pH至p17.0～pH7.2，稀释至1000mL。每试管中加入4mL该液体培养基，高温灭菌(121⁰C下15min)。

（3）稀释剂(磷酸盐级冲溶液):用于稀释土壤样品的溶液是1mmol·L^-1的K₂HPO₄^-KH₂PO₄级冲溶液，其配制系取上述备用液中KH₂PO₄溶液4mL和K₂HPO₄溶液1mL，稀释至1L。此级冲液的pH值为pH7.1～pH7.4，分别取若干份90 MI，此缓冲液分装于若干个有盖的瓶中(或150 ml三角瓶中，用铝箔封严),然后，高温灭菌(121⁰C下15min)。

（4）修正后的Griess-llosvay试剂:①重氮试剂:将0.5g对氨基苯磺胺溶于100 mL盐酸溶液[c(HCI)=2.4 mol·L^-1〕中，低温贮存。②藕合剂:将0.3g的N-(1-萘基)-乙二胺盐酸盐溶于100mL盐酸溶液[c(HCI)]=0.12 mol·L^-1〕中，保存在棕色瓶中，低温贮藏。

（5）二苯胺试剂:取50mg二苯胺溶于25mL浓硫酸中。在有玻璃塞子的棕色瓶中避光贮存，其有效使用时间最多两周。

（6）碳酸钾溶液〔p(K₂CO₃)=20g ·L^-1)]，经过滤灭菌处理后用于调节试管中的pH值。

4、操作步骤

称取10.00g新鲜土样和上述90mL灭过菌的缓冲液一起加入到匀桨机中，搅拌30S或60S，然后转移至高压灭过菌的150mL三角瓶中，摇匀后吸取10mL该稀释度为10^-1的土壤悬浮液至另一只预先灭过苗的装有90mL磷酸盐级冲液的三角瓶中，摇匀，得到稀释度为10⁰¹的土壤悬浮液。继续稀释至10^-5。如果硝化细菌的数量较高，应进一步稀释至10^-6,10^-7或10^-8。取5个连续的稀释度，将其分别接种到装有 4mL灭菌的液体培养基的试管中。每管接种土壤悬浮液1mL，每个稀释度重复接种5管，即每个土样共制备25个试管，同时设置不接种的对照。试管在25⁰C～30⁰C避光培养(培养箱中或合适的室温条件下)。

21d后，取试管进行初步观察， pH指示剂颜色由蓝绿色变为黄色表明发生了氨的氧化。为了确认NO₂^-的生成，可用比色盘进行定性测定。在无菌条件下从试管中吸取0.1 mL液体,放入比色盘凹槽中，先加入1滴重氮试剂，然后加入1滴藕合剂，如果有品红至红色出现，表明有NO₂^-存在，并与未接种的对照比较。

继续培养至少6周，每周检查一次颜色的变化，直到有N0₂^-反应的试管数量在最后两周不再增加为止。培养结束时，要对颜色较浅或没有颜色的试管进行NO₂^-的定性检侧。对没有NO₂^-反应的试管，要用二苯胺试剂检测NO₃^-的含量，因为亚硝酸氧化微生物有可能已将NO₂^-全部氧化为NO₃^-。硝酸盐检测的灵敏度不如亚硝酸盐高。

5、结果计算

记录最后检测的每个稀释度中有NO^2-和NO₃^-反应的试管数，再计算氮氧化细菌群体的丰度。

结果以每克干土的氨氧化细菌个数表示。

五、亚硝酸氧化细菌的测定

1、方法原理

亚硝酸氧化细菌氧化的基质是NO₂^-，通过定性检测NO₂^-的消失或NO₃^-的生成，最终确定单个试管中是否有亚硝酸级化微生物的存在，并用最大可能计数法估计亚硝酸氧化微生物的数量。

2、试剂

（1）培养基备用液:除用亚硝酸钾溶液[p(KNO2)=8.5g·L^-1〕取代硫酸铵溶[(NH₄₂SO₄=5.0g·L^-1〕外。

（2）培养基:分别取1.0mL KNO₂溶液、1.0mL CaC1₂·2H₂O溶液、1.0mL MgSO₄7H₂O溶液、4.0mL K₂HPO₄溶液、1.0mL熬合铁溶液和1.0mL微量元素溶液混合，稀释至1000mL。每试管中加入4mL该液休培养基，高退灭菌(121⁰C下15 min)。灭菌后培养基的pH为pH7.0～pH7.3。

（3）稀释剂(磷酸盐缓冲溶液)和修正后的Gricss-Ilosvay试剂的配制方法相同。

3、操作步骤

对于亚硝酸氧化细菌计数所用的稀释度，大体与氨氧化细菌计数所用的相同。试管在25⁰C～30⁰C避光培养21d后，用修正后的Griess-Ilosvay试剂检测NO₂^一的存在。在没有NO₂^—反应的试管，表明亚硝酸盐已经发生了氧化。

4、结果计算与表示方法

记录最后检侧的每个稀释度中有NO₂^一反应的试管数。结果以每克干土的亚硝酸氧化细菌个数表示。

参考资料：土壤农业化学分析方法